Polyakrylamidgelelektrofores möjliggör högupplöst separation av proteiner extraherade från biologiska prover, men det kräver mer än en dag av förbehandling för att återställa de separerade proteinerna som fångats inuti gelén för detektion med masspektrometri. BAC-DROP, vår nya elektrofores -teknik, använder en löslig form av polyakrylamidgel, vilket gör att provbehandlingen kan slutföras på cirka fem timmar. Den utvecklade tekniken möjliggör snabb diagnos av virus och sjukdomsproteinmarkörer.

Masspektrometri (MS) är en kraftfull metod för biomarkörsanalys eftersom den möjliggör mycket känslig och noggrann mätning av målmolekyler i kliniska prover. Tillämpningen av MS för klinisk diagnos, såsom nyfödd metabolisk screening, har gått framåt med fokus på metabolitmarkörer. MS -mätning av proteiner används för närvarande huvudsakligen för nya markörupptäcktstudier, men det finns ett växande intresse för dess tillämpning för klinisk markördiagnos som ett alternativ till immunanalyser.

MS-baserad kvantifiering av proteinbiomarkörer utförs huvudsakligen med en bottom-up-metod med användning av peptidfragment erhållna genom enzymatisk proteindigering med trypsin. Standard matsmältningsprotokoll kräver en reaktionstid på mer än 20 timmar, vilket är en hastighetsbegränsande faktor i arbetsflöden för förberedelse av prov.

Även om proteinkvantifiering av MS är mycket känslig, plasma och serumproteom är mycket komplexa, och störningar från andra komponenter utgör en betydande utmaning. För högprecisionsdetektering av målmarkörer, tillvägagångssätt för förborttagning av viktiga serumproteinkomponenter såsom albumin eller selektiv berikning av målmarkörer med antikroppskolonner har rapporterats, men effekten utanför målet på kvantitativa resultat och svårigheten att bearbeta flera prover förblir hinder.

I den här studien, vi fokuserade på lösbara polyakrylamidgeler med N, N'-Bis (akryloyl) cystamin (BAC) som en tvärbindare för att lösa dessa problem. BAC-tvärbundna polyakrylamidgeler löses lätt upp genom reduktionsbehandling, tillåter återvinning av proteiner som har rymt in i lösningen. Vi fann att de återvunna proteinerna var lämpliga för snabb trypsinsmältning under höga temperaturförhållanden, och vi lyckades upprätta en metod för provberedning med hög genomströmning för MS-baserad biomarkörkvantifiering, som vi kallade BAC-DROP (BAC-Gel Dissolution to Digest PAGE-Resolved Objective Proteins).

Högupplöst proteomfraktionering med BAC-DROP är särskilt effektiv för MS-kvantifiering av riktade spårmarkörproteiner härledda från kliniska prover. Genom att införa BAC-DROP i det MS-baserade kvantifieringsarbete för det inflammatoriska biomarkör C-reaktiva proteinet (CRP), vi kunde slutföra provbehandlingen på bara 5 timmar och kvantifierade framgångsrikt CRP från ett 0,5 µL humant serumprov. Vi lyckades också med en serologisk diagnos av hepatit B-virus (HBV) -infektion genom HBsAg-kvantifiering kombinerat med BAC-DROP och MS. Nyligen, intresset för MS -diagnos av virusinfektioner har ökat snabbt, som exemplifierat av diagnosen COVID-19. Provberedningssättet med hög genomströmning av BAC-DROP som visas i denna studie kommer att vara tillämpligt inte bara på HBV utan även på andra smittsamma virussjukdomsprover.