Arbetsflöde av NJIT-teamets CMS-metod, som kombinerar vätskekromatografi (LC), elektrokemisk oxidation (EC) och masspektrometri (MS)-baserad kvantitativ mätning av proteinöverflöd. Kredit:NJIT
New Jersey Institute of Technology (NJIT) forskare har avslöjat en ny labbteknik som de säger representerar ett "paradigmskifte" i hur farmaceutiska laboratorier testar och producerar nya proteinbaserade läkemedel, såsom terapeutiska monoklonala antikroppar som utvecklas för att behandla en mängd olika sjukdomar, från cancer till infektionssjukdomar.
Forskare säger att deras elektrokemibaserade tillvägagångssätt, som beskrivs i tidskriften Analytical Chemistry , skulle kunna tillåta säkerhets- och kvalitetstestning av kommande bioterapeutika att göras på en bråkdel av den tid som krävs av konventionella metoder, som vanligtvis kräver lång och kostsam produktion av vissa biomaterial som används för provtestning.
Studien genomfördes i samarbete med forskare från Merck, Johnson &Johnson och Ohio University.
"Denna metod som vi har utvecklat på NJIT har potential att ha en stor inverkan inom kvantitativ proteomik, och den representerar ett paradigmskifte inom läkemedelsindustrin när det gäller övervakning av biofarmaceutiska produkter och processföroreningar för kvalitetskontroll", säger Hao Chen, tidningens tidningsman. motsvarande författare och professor vid NJIT:s institution för kemi och miljövetenskap.
"Med den här studien har vi nu visat ett tillvägagångssätt som kan kvantifiera läkemedelsprodukter och bearbeta föroreningar mycket snabbare och mer exakt än vad som varit möjligt... Vi förväntar oss att det kommer att bli mycket användbart för att underlätta terapeutisk protein- och vaccinutveckling för behandling och förebyggande av olika sjukdomar i framtiden."
Traditionellt innebär sådan testning, eller proteinkvantifiering, tidskrävande beredning av syntetiska isotopmärkta peptider som används som interna standarder för att mäta totala proteinkoncentrationer i ett prov – vilket hjälper forskare att aktivt övervaka effektiviteten och säkerheten hos terapeutiska proteinkomponenter under hela läkemedelsutvecklingen process.
För att övervinna denna begränsning utvecklade Chens labb ett tillvägagångssätt för coulometric mass spectrometri (CMS) för absolut kvantifiering av proteiner utan användning av standarder. Metoden tillämpar istället vätskekromatografi-masspektrometri och en elektrokemisk flödescell för att snabbt kvantifiera och detektera förändringar i målproteiner eller peptider baserat på elektrokemiska signaturer.
"Istället för att vänta i veckor för att få standarder eller reagens i traditionella tillvägagångssätt, skulle man kunna utföra CMS-kvantifieringsexperiment direkt. Det skulle således underlätta spårning av läkemedelsföroreningar som upptäckts under processen och säkerställa deras effektiva rensning med processoptimering och kontroll", säger Chen.
"En sådan apparat tillåter oss att separera peptider efter proteinnedbrytning med vätskekromatografi, övervaka peptidoxidation i den elektrokemiska flödescellen för att producera en elektrisk ström och mäta oxidationsutbytet med masspektrometri", förklarade tidningens första författare och NJIT Ph.D. . student Yongling Ai. "Kombinationen av elektriska strömsignaler tillsammans med oxidationsutbytet ger tillräcklig information för absolut kvantifiering av peptider och proteiner."
I sin studie visade teamet sin CMS-metod genom att uppnå absolut kvantifiering av flera proteiner (β-laktoglobulin B, α-laktalbumin och kolsyraanhydras) i en blandning i en körning, utan att använda några standarder.
Teamet visade också upp metodens kapacitet för att upptäcka proteindeamidering – en vanlig nedbrytningshändelse i terapeutiska proteiner som är ett resultat av fysiska eller kemiska påfrestningar under hela tillverkningsprocessen och lagringen.
Teamet har framgångsrikt kvantifierat flera proteinnedbrytningsprodukter, inklusive en nyckelmellanprodukt för proteinnedbrytning – bildandet av succinimid – vilket aldrig tidigare har gjorts med absolut kvantifiering på grund av brist på standarder, enligt studiens författare.
"Bristen på standarder orsakas av utmaningarna i deras de novo-syntes", sa Chen. "Att kunna kvantifiera deamideringsprodukterna och intermediärerna korrekt kan ge bättre förståelse för terapeutisk proteinnedbrytning och potentiellt skapa ett nytt sätt att undersöka sjukdomspatologier och åldrandeprocesser."
Nu planerar Chens labb att tillämpa sin nya metod för storskalig kvantifiering av tusentals proteiner i en körning. De planerar också att förbättra känsligheten i sin CMS-analys för att möjliggöra kvantifiering av mycket låga nivåer av proteiner i komplexa biologiska prover, vilket kan gynna forskningsinsatser som sträcker sig från klinisk diagnostik och läkemedelsupptäckt till precisionsmedicin för vilken identifiering och kvantifiering av prover på molekylär nivå är nödvändigt.
"Eftersom proteiner utför ett brett spektrum av funktioner inom organismer, är vikten av absolut proteinkvantifiering svår att överskatta," sa Chen. "CMS bör påskynda processer för sjukdomsdiagnostik, läkemedelsupptäckt och utveckling, och det öppnar nu en ny dörr för biologer och biokemister att utforska mängder av proteiner i människokroppen som kan tjäna viktiga biologiska funktioner eller roller som sjukdomsbiomarkörer och läkemedelsmål. " + Utforska vidare
