Schematisk beskrivning av det dubbla temperaturkontrollsystemet utvecklat av Gal4p riktad evolution och uttrycksreglering för förbättring av isoprenproduktion. Kredit:Jiaxi Lin
Bagerijäst, Saccharomyces cerevisiae, har konstruerats omfattande för att producera en mängd olika kemikalier som inte produceras naturligt av jäst, inklusive den viktiga monomeren för syntetiskt gummi, isopren. Alla organismer är dock naturligt utvecklade för bättre överlevnad snarare än maximerad biosyntes av produkter av mänskligt intresse. S. cerevisiae är inget undantag. Försämrad celltillväxt observerades under dess konstruktion genom vägkompartmentering för förbättrad isoprenbiosyntes.
För att ta itu med denna fråga har forskare från College of Chemical and Biological Engineering vid Zhejiang University utvecklat ett temperaturkänsligt dynamiskt kontrollsystem för att reglera initieringstiden för isoprenbiosyntes under fermenteringen. Denna studie publicerades online i Frontiers of Chemical Science and Engineering .
Den naturliga transkriptionsaktivatorn Gal4p av S. cerevisiae konstruerades för att få temperaturkänslighet och under tiden drevs dess uttryck av en värmechock-promotor. På detta sätt utvecklades ett system med dubbla temperaturreglering, vars tillämpning ledde till begränsat uttryck av pathway-gener vid optimal temperatur för celltillväxt (30 °C) och förbättrat genuttryck när odlingstemperaturen ändrades till optimal temperatur för isoprensyntes (37 °C).
Den "kylkänsliga" Gal4p-mutanten som spelar nyckelrollen skapades av den Nobelprisbelönta regisserade evolutionsteknologin. För att underlätta snabbt och korrekt urval av mutanterna med temperaturkänslighet från det slumpmässiga mutantbiblioteket som innehåller tusentals mutanter, etablerades en tillväxtindikerad screeningmetod med hög genomströmning baserad på cytotoxiciteten av 5-fluoruridin bildad av URA3-katalyserad omvandling av 5- fluororotinsyra. Den negativa korrelationen mellan Gal4p-aktivitet vid en viss temperatur och biomassan av 5-fluoruridin-ackumulerande stammar möjliggjorde urval av Gal4p-mutanter med lägre aktivitet vid 30 °C och högre aktivitet vid 37 °C.
När den "förkylningskänsliga" Gal4p-mutanten uttrycktes under kontroll av en värmechock-promotor, ökades dess regulatoriska aktivitet vid den tillåtande temperaturen ytterligare på grund av den förhöjda uttrycksnivån och det basala uttrycket av väggenerna vid den restriktiva temperaturen reducerades ytterligare. Användning av denna dubbla temperaturkontrollstrategi ledde till 34,5 % respektive 72 % förbättringar i celltillväxt och isoprenproduktion av S. cerevisiae. Denna studie rapporterar skapandet av de första köldkänsliga varianterna av Gal4p genom riktad evolution och tillhandahåller ett dubbelt temperaturkontrollsystem för jästteknik som också kan bidra till biosyntesen av andra högvärdiga naturprodukter. + Utforska vidare
