Biokemister och molekylärbiologer använder elektrofores för att separera makromolekyler som proteiner och nukleinsyror. Detta gör det möjligt för forskare att isolera och analysera enskilda proteiner eller nukleinsyrasekvenser i en komplex blandning. Ett typiskt exempel på elektrofores i laboratoriet är en mikrobiolog som använder polymeras kedjereaktion (PCR) för att separera DNA-fragment som produceras i en mikrobiell gemenskap. Oavsett formålet kräver elektrofores alltid användningen av en buffertlösning.

TL; DR (för länge, läste inte)

Elektrofores skiljer makromolekyler som protein och nukleinsyror i storlek, laddning och andra egenskaper. För elektrofores som skiljer sig efter laddning använder forskare buffert för att sända den laddningen genom gelén. Bufferten upprätthåller även gelén vid ett stabilt pH, vilket minimerar förändringar som kan uppstå i proteinet eller nukleinsyran om de utsätts för instabil pH.

Principer för elektrofores

Elektrofores separerar molekyler längs en gradient baserad på deras storlek, laddning eller andra egenskaper. Den gradienten kan vara ett elektriskt fält eller, i fallet med denatureringsgradientgelelektrofores (DGGE), en denatureringsmedel, såsom en blandning av urea och formamid. Proteiner kommer att migrera mot anoden om negativt laddad och katoden om den är positivt laddad. Eftersom större molekyler migrerar långsammare än mindre molekyler, kan forskare mäta avståndet som reste och använda logaritmer för att bestämma storleken på fragmenten.

Denaturering Gradient Gel Electrophoresis

Med DGGE flyttar DNA längs en gradient av ökande denatureringskraft tills kraften är tillräcklig för att denaturera eller utveckla det specifika DNA-fragmentet helt. Vid denna tidpunkt slutar migreringen. Forskare kan använda denna metod för att separera fragment baserat på deras individuella känslighet för denaturering.

Vad bufferten gör

Vid elektrofores som skiljer sig utifrån laddning överför joner i bufferten laddningen är nödvändig för separation. Bufferten, genom att tillhandahålla en reservoar med svag syra och bas, håller också pH inom ett smalt område. Detta är viktigt eftersom strukturen och laddningen av ett protein eller en nukleinsyra kommer att förändras om den utsätts för signifikanta pH-förändringar, vilket förhindrar korrekt separation.

Typiska buffertar

Olika buffertar är idealiska för att upprätthålla elektroforesen gel vid olika önskade pH-intervall. Typiska buffertar som används av forskare för detta ändamål innefattar ättiksyra, borsyra, fosforsyra och citronsyra såväl som glycin och taurin. Generellt bör pKa-värdet (syradissociationskonstanten) ligga nära det önskade pH-värdet. Det är att föredra oss buffertar som ger en låg laddningsstorlek så att de inte hanterar för mycket ström.