Celllys:
- Lysproceduren börjar vanligtvis med återsuspension av bakterieceller i en buffert som innehåller NaOH. Denna buffert skapar en alkalisk miljö med ett högt pH, vanligtvis runt pH 12-12,8.
– Vid detta höga pH störs bakteriens cellmembran och cellväggar, vilket leder till cellys. De cellulära komponenterna, inklusive plasmid-DNA, frisätts i lysatet.
Denaturering av kromosomalt DNA:
- Den höga pH-miljön som skapas av NaOH riktar sig specifikt mot och denaturerar bakteriernas kromosomala DNA. Kromosomalt DNA är vanligtvis stort och komplext och består av en enda cirkulär molekyl.
- De starka alkaliska förhållandena gör att vätebindningarna mellan komplementära DNA-strängar bryts, vilket resulterar i denaturering och fragmentering av kromosomalt DNA. Denna denaturering stör effektivt den strukturella integriteten hos det kromosomala DNA:t, vilket gör det icke-funktionellt.
Bevarande av plasmid-DNA:
– Till skillnad från kromosomalt DNA är plasmid-DNA mer resistent mot denaturering av NaOH. Plasmidmolekyler är vanligtvis små, cirkulära och dubbelsträngade, med en superlindad struktur som förbättrar deras stabilitet.
- Den supercoilade konformationen av plasmid-DNA gör att den tål de alkaliska förhållandena bättre än kromosomalt DNA. Därför, medan kromosomalt DNA är denaturerat, förblir plasmid-DNA intakt och bibehåller sin kovalent slutna cirkulära struktur.
Neutralisering:
- Efter lyseringssteget neutraliseras lysatet som innehåller det denaturerade kromosomala DNA:t och intakt plasmid-DNA med användning av en buffert som innehåller ett neutraliserande medel, såsom Tris-HCl eller acetatbuffert.
- Neutralisering för tillbaka lysatets pH till ett fysiologiskt område, vanligtvis runt pH 7-8. Detta steg är viktigt för att stoppa denatureringsprocessen och säkerställa stabiliteten hos plasmid-DNA.
Isolering av plasmid-DNA:
- Efter neutralisering kan lysatet bearbetas ytterligare för att isolera plasmid-DNA. Detta kan involvera ytterligare steg såsom centrifugering, rening och storleksbaserade separationstekniker för att separera plasmid-DNA från andra cellulära komponenter.
Genom att selektivt denaturera kromosomalt DNA samtidigt som integriteten av plasmid-DNA bevaras, spelar NaOH en avgörande roll i lysproceduren, vilket möjliggör effektiv isolering av kovalent slutna plasmidmolekyler för olika nedströmsapplikationer, inklusive DNA-sekvensering, kloning och genteknikexperiment.
