Detta protokoll beskriver en vanlig metod för att mäta nitratreduktasaktivitet med användning av natriumnitrit som standard.
Material:
* Växtmaterial: Färska blad, rötter eller andra vävnader som innehåller nitratreduktas.
* extraktionsbuffert:
* 100 mM Tris-HCl-buffert, pH 7,5
* 1 mm EDTA
* 10 mm DTT (Dithiotreitol)
* 0,1% (vikt/volym) bovint serumalbumin (BSA)
* Reaktionsblandning:
* 100 mM kaliumfosfatbuffert, pH 7,5
* 10 mM natriumnitrat
* 1 mm nadh
* natriumnitritstandardlösning: Förbered en standardlösning av känd koncentration (t.ex. 100 ppm).
* griess reagens: (Se specifika protokollinstruktioner)
* spektrofotometer: För mätning av absorbans vid 540 nm.
* centrifug: För att separera cellavfall.
* isbad: För att upprätthålla kalla temperaturer.
* pipetter och tips: För exakta volymmätningar.
Förfarande:
1. provberedning:
* Skörda växtmaterial och skölj snabbt med kallt destillerat vatten.
* Väg en lämplig mängd vävnad (t.ex. 0,1-1 g) och slip den i en murbruk och stöt med flytande kväve eller med en homogenisator i extraktionsbuffert.
* Centrifugera homogenatet vid 10 000 g under 10 minuter vid 4 ° C för att avlägsna cellskräp. Supernatanten är ditt enzymekstrakt.
2. nitratreduktasanalys:
* Förbered en serie rör som innehåller reaktionsblandningen, inklusive tomma ämnen utan enzymekstrakt och rör med olika koncentrationer av natriumnitritstandard.
* Tillsätt en lämplig volym av enzymekstrakt till reaktionsrören.
* Starta reaktionen genom att tillsätta NADH.
* Inkubera rören vid 30 ° C under en viss tid (t.ex. 30 minuter).
* Avsluta reaktionen genom att lägga till Griess -reagens.
3. Mätning av nitritproduktion:
* Inkubera rören i mörkret i minst 15 minuter för att möjliggöra färgutvecklingen.
* Mät absorbansen vid 540 nm med en spektrofotometer.
* Förbered en standardkurva med de kända koncentrationerna av natriumnitrit.
* Beräkna mängden nitrit som produceras av enzymekstraktet med hjälp av standardkurvan.
4. Beräkning av nitratreduktasaktivitet:
* Expressnitratreduktasaktivitet som µmol av nitrit producerad per minut per gram färsk vikt (FW) eller protein .
Obs:
* Detta protokoll är en grundläggande disposition, och specifika modifieringar kan vara nödvändiga beroende på växtarter och den experimentella installationen.
* Se till att alla lösningar är förberedda färska och lagrade på lämpligt sätt.
* Använd reagens av hög kvalitet för exakta resultat.
* Kontroll för bakgrundsabsorbans genom att mäta absorbansen av tomma ämnen utan enzymekstrakt.
* Upprepa analysen minst tre gånger för att säkerställa reproducerbarhet.
griess reagens:
* Griess-reagenset används för att detektera nitrit genom att reagera med det för att producera ett lila-färgat azo-färgämne.
* Olika Griess -reagens kan användas, så se det specifika protokollet för beredning och användning.
Alternativa metoder:
* Andra metoder för att mäta nitratreduktasaktivitet inkluderar användning av nitrat som substrat och detektera reduktionen av nitrat till nitrit.
* spektrofotometrisk mätning kan användas för att direkt mäta förändringen i NADH -koncentrationen över tid.
Tolkning:
Nitratreduktasaktiviteten är en indikator på växtens förmåga att reducera nitrat till nitrit, vilket är ett avgörande steg i kväveassimilering. Att jämföra aktiviteten i olika vävnader eller under olika förhållanden kan avslöja värdefull information om växtens kvävemetabolism.
Ytterligare information:
* protokollmodifieringar för specifika växtarter eller förhållanden: Se relevant vetenskaplig litteratur eller kontaktexperter för vägledning.
* Felsökning: Se felsökningsguider eller konsultera experter om du stöter på några problem med analysen.
Detta protokoll ger en allmän ram för att mäta nitratreduktasaktivitet med användning av natriumnitrit som standard. Anpassa den till dina specifika behov och säkerställa exakta resultat.
