Av Anne Mullenniex Uppdaterad 24 mars 2022
Kvantifiera ditt RNA-prov genom att mäta dess absorbans av ultraviolett ljus (UV). En nano-drop spektrofotometer kommer att använda endast en eller två mikroliter av ditt prov, som du kan återvinna. Andra spektrofotometrar kräver ett mycket större prov. Extinktionskoefficienten för nukleotider vid en UV-våglängd på 260 nm i en 1 cm ljusväg är 20. Baserat på denna extinktionskoefficient är absorbansen för 40 µg/ml RNA under samma förhållanden en. Med hjälp av denna information kan du beräkna koncentrationen av ditt RNA-prov.
Gör en spädning, om nödvändigt, av ditt prov. En standardutspädning för en mikrokyvett är 1:40. Gör denna utspädning genom att tillsätta 2 µL RNA-prov till 78 µL sterilt vatten.
Följ protokollen för din speciella spektrofotometer för att kalibrera maskinen genom att använda en blank och sedan bestämma den optiska densiteten för ditt prov vid en UV-våglängd på 260nm.
Multiplicera absorbansen av ditt prov med din utspädningsfaktor med 40 μg RNA/ml. Ekvationen skulle vara:"RNA-koncentration (µg/ml) =(OD260) x (utspädningsfaktor) x (40µg RNA/ml)/(1 OD260-enhet)" (Hofstra.edu) Till exempel:Om du spädde ut ditt prov med 1:40 och din absorbansavläsning var 0,08,0,0 skulle du multiplicera 8 x 040 x 8 x 040 1 µg/ml =0,13 µg/μL
Ta reda på renheten av ditt prov genom att ta en annan absorbansavläsning vid 280nm UV-våglängd. Förhållandet OD 260/OD 280 indikerar om – och vid vilken nivå – ditt prov är kontaminerat med protein eller fenol. Ett resultat på 1,8 till 2,0 indikerar kvalitets-RNA.
Glöm inte att kalibrera din spektrofotometer. Att köra en snabb elektroforetisk gel kommer att bekräfta dina specifika resultat.
Anta inte att ditt prov är rent. Att ta sig tid för ett OD260/OD280-förhållande sparar tid och pengar på vägen.
