Fluorescens är ett otroligt användbart verktyg för experimentell biologi och det har precis blivit lättare att utnyttja, tack vare arbetet från en grupp forskare vid University of Chicago.

Gruppen skapade ett nytt verktyg som en del av en labbklass inom Biophysical Sciences forskarutbildning vid University of Chicago, gör det möjligt för sina användare att nollställa spektrumet från specifika strukturer inom prover.

"Största delen av arbetet gjordes av doktorander under deras första termin, sa Adam Hammond, läroplanschef och universitetslektor på programmet Biofysiska vetenskaper vid Gordon Center for Integrative Sciences. "Deras entusiasm och kreativitet gjorde det här projektet möjligt."

Som gruppen rapporterar denna vecka i journalen Granskning av vetenskapliga instrument , från AIP Publishing, Målet med deras instrumentering är att observera ljusspektrumet som kommer från en del av ett prov i ett mikroskop – men inte hela provet.

"Värdet med ett mikroskop är att det låter dig observera variationerna inom ett prov, " förklarade Hammond. "Vi ville kunna fråga, "vad är spektrumet från den specifika strukturen där?" Detta är inte en ny önskan och instrument som kan göra det finns, men ingen, så vitt jag vet, lika enkelt som vår."

Under sitt första år på forskarskolan, Peter Dahlberg, artikelförfattare som nu är vid Stanford University i Kalifornien, fick bygga ett selektivt excitationsmikroskop. "Undermedvetet, Jag tror att idén började då, " sa han. "Varför inte göra samma sak, men omvänt?"

Hur fungerar gruppens verktyg? Först, det delar upp ljuset som kommer från ett prov. Hälften går till en kamera för normal avbildning och den andra hälften går till en spektrometer. Men innan det kommer till spektrometern, den halvan passerar genom ett fåtal optiska komponenter som tillåter användare att välja valfri del av bilden och blockera allt annat.

"Det finns inget knepigt med dessa optiska komponenter - en rumslig ljusmodulator (SLM) mellan korsade polarisatorer, "Sade Hammond. "SLM är vanliga nu, med minst tre i många moderna digitala projektorer. De har en rad pixlar som var och en kan manipulera fasen av ljuset som passerar genom dem."

Även om det finns flera knep du kan göra med en SLM, gruppen använder den enklaste.

"Vi fokuserar bilden från provet på SLM och flyttar fasen för endast de pixlar som vi vill få ett spektrum från, " fortsatte han. "Det förskjutna ljuset passerar genom en andra polarisator; allt annat blockeras. Sedan samlas det ljuset upp och kan skickas till vilken typ av optiskt instrument du väljer. Just nu skickar vi den till en liten UV/Vis-spektrometer för att få ett fullt spektrum."

Gruppens instrument är, kanske, bäst sammanfattas som ett "arbetshästverktyg". Dess enkla koncept och komponenter kan enkelt anpassas för många olika ändamål och läggas till befintliga mikroskop enkelt och billigt.

"Vi bestämde oss för att bygga den för en specifik användning:För att mäta spektralförskjutningen av fluorescerande indikatorer, ", sa Hammond. "Vi tänkte inte riktigt på att göra det mångsidigt eller hur vi skulle ordna SLM och polarisatorer när vi började. Men vi hade en njutbar serie av insikter längs vägen."

En sådan insikt var att deras instrument också kunde användas för absorbansmätningar.

"Ofta, de viktigaste proverna är små och svåra att skapa eller rena – som kristallformer, " sa han. "Det är mödosamt arbete att rena de två typerna från varandra i tillräckliga mängder för att fylla en kyvett. När du lägger blandningen på ett objektglas, det blir lättare. Kristaller kan mätas en i taget, och så kan celler som uttrycker variabla kromoforer (molekyler som ansvarar för färg). Detta öppnar upp ett helt nytt område som inte var en del av vår ursprungliga plan."

Gruppens instrument kan "ta hela spektrat av en eller flera användardefinierade regioner av intresse samtidigt som de fångar standardfluorescensbilder av hela synfältet, "Sade Hammond. "Så vad du kan göra med det beror på provet. Vi använder den nu för att följa fluorescerande sonder för pH och kalcium. Men ett exempel på en mycket annorlunda tillämpning är dess förmåga att identifiera individuella mikroorganismer i ett blandat prov genom deras absorbansfingeravtryck."

Vad händer härnäst för forskarna?

"Genom att använda en pulserande excitationskälla, fluorescenslivslängden för en sond kan mätas från en utvald region av intresse, ", sa Hammond. "En intressant potentiell tillämpning är inom neurovetenskapen för att lösa enstaka verkanspotentialer med färgämnen som är känsliga för membranpotential. Mätningar av fluorescenslivslängd ger en fördel jämfört med direkta fluorescensmätningar eftersom de är oberoende av koncentrationen av sonden."