Kemister på ITbM, Nagoya University har utvecklat ett superfotostabilt fluorescerande färgämne som heter PhoxBright 430 (PB430) för att visualisera cellulär ultrastruktur med superupplöst mikroskopi. Den exceptionella fotostabiliteten hos detta nya färgämne möjliggör kontinuerlig STED -avbildning. Med sin förmåga att märka proteiner med fluorescerande etiketter, PB430 visar dess användning i 3D-konstruktionen och mångfärgad avbildning av biologiska strukturer.

Superupplöst fluorescensmikroskopi, som fick Nobelpriset i kemi 2014, tillåter forskare att visualisera biologiska system och få en detaljerad förståelse för biomolekylernas komplexa dynamik. Särskilt, stimulerad utsläppsminskning (STED) mikroskopi används i stor utsträckning för att undersöka processer i levande system på grund av dess snabba förvärvshastighet och kompatibilitet med många biologiska prover.

Kemister vid Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM) vid Nagoya University har utvecklat ett nytt fotostabilt fluorescerande färgämne, PhoxBright 430 (PB430), vilket möjliggör kontinuerlig superupplöst STED-avbildning av fluorescensmärkta celler. Eftersom PB430 innehåller en funktionell del för att möjliggöra konjugering med en antikropp, specifika biomolekylmål i en cell kan färgas genom immunfluorescens. Den exceptionella fotostabiliteten hos PB430 gjorde det möjligt för forskare att konstruera en 3D-STED-bild av cellulära mikrotubuli och uppnå flerfärgad STED-avbildning av fluorescerande immunomärkta cytoskeleton genom att kombinera fotostabila PB430 och kommersiellt tillgängliga färgämnen.

De unika egenskaperna hos PB430 gör det till ett kraftfullt verktyg för att avslöja strukturer och funktioner hos celler, och kan tillämpas på den långvariga visualiseringen av rörelsen av organeller och molekyler inom celler. Resultaten av denna studie rapporterades nyligen i Journal of the American Chemical Society .

För att uppnå hög upplösning i STED -mikroskopi, ett biologiskt prov märkt med en fluorofor (ett fluorescerande färgämne som används för att märka biologiska prover som proteiner, vävnader och celler) bestrålas med en fluorescens-excitationsstråle tillsammans med en munkformad STED-stråle för att undertrycka exciteringen av de omgivande molekylerna. Även om det är en kraftfull teknik, behovet av en högintensiv STED-stråle, som orsakar fotoblekning av färgämnen, har hämmat den praktiska användningen av STED -mikroskopi vid kontinuerlig levande cellbildning.

Forskare har tidigare rapporterat ett fluorescerande färgämne, C-Naphox, som uppvisar stark fotostabilitet vid STED -avbildning. Gruppen har nu optimerat strukturen för C-Naphox och utvecklat det nya fotostabila fluorescerande färgämnet, som kan användas för visualisering av strukturer i celler.

"C-Naphox har visat sig vara ett extremt fotostabilt färgämne för STED-avbildning av olika material, så vi bestämde oss för att justera dess egenskaper ytterligare och tillämpa den för att visualisera ultrastrukturer, "säger Masayasu Taki, en docent vid ITbM och en av ledarna för denna forskning. "Vårt nya färgämne, PB430 visar ökad löslighet i vatten, fluorescerar effektivt i vattenhaltiga medier, och kan märka antikroppar. Vi var glada att observera att den också uppvisar hög fotostabilitet under STED -förhållanden, säger Taki.

Chenguang Wang, en postdoktor i professor Shigehiro Yamaguchis forskargrupp vid ITbM, syntetiserade PB430 och utförde STED -avbildningsexperimenten. På liknande sätt som C-Naphox, det nya fluorescerande färgämnet är luftstabilt och består av ett strukturellt förstärkt, ringsmält, π-konjugerat skelett som innehåller en fosfol P-oxid enhet, som är ursprunget till namnet PhoxBright. Istället för trifenylamindelen, PB430 har en karboxylsyragrupp som kan konjugera till antikroppar för immunmärkning via bildning av en N-hydroxylsuccinimidyl (NHS) ester.

STED-avbildningsexperiment av PB430-konjugerade antikroppar i fixerade HeLa-celler ledde till fluorescensbilder av immunmärkta mikrotubuli, med endast liten fotoblekning. PB430 fungerade som en fluorescerande markör för proteiner och dess fluorescensintensitet bibehölls även när den konjugerades.

"Den höga fotostabiliteten hos PB430 möjliggör fluorescensavbildning som inte var lätt möjlig med konventionella färgämnen, "förklarar Taki." Till exempel, PB430 kan användas vid 3D-STED-avbildning av cytoskelet, eftersom den tål den kontinuerliga STED-strålen i z-axeln efter avbildning i xy-axeln. "

Vidare, gruppen visade att PB430 kunde appliceras på flerfärgad STED -avbildning genom att dra fördel av skillnaden i fotostabilitet bland olika fluorescerande färgämnen. De utförde STED -avbildningsexperiment av mikrotubuli och vimentin (mellanliggande filamentproteiner) i cytoskeletet, immunmärkt med PB430 och Alexa Fluor 430 (ett fluorescerande färgämne), respektive. När Alexa Fluor 430 fotoblekar efter att ha tagit den första STED -bilden, den andra bilden visar bara PB430-märkta mikrotubuli. Att dra den första bilden från den andra bilden avslöjar Alexa Fluor 430-märkta vimentinfilament.

"Vanligtvis, mångfärgad STED -avbildning kräver flera excitationslasrar och en enda STED -laserstråle, men i kombinationen Alexa Fluor 430 med PB430, vi behöver bara ett par excitation- och STED -lasrar, "förklarar Taki." Genom att använda PB430, vi tror att det kommer att vara möjligt att genomföra flerfärgad STED -avbildning med ett antal olika kombinationer av olika fluorescerande färgämnen. Nästa steg är att förbättra färgmembranets cellmembran för att visualisera funktionerna hos många andra cellstrukturer, " han fortsätter.

"Vår forskning har visat att den starka fotostabiliteten och fysiologiska kompatibiliteten hos PB430 möjliggör upprepad avbildning såväl som 3D-avbildning och mångfärgad avbildning av celler med STED-mikroskopi, "säger Yamaguchi." Vi hoppas att vi kan applicera vårt fluorescerande färgämne för långvarig levande cellavbildning med STED -mikroskopi och enmolekylmikroskopi, för att undersöka olika biologiska processer. "