Forskare vid universitetet i Würzburg har kunnat öka nuvarande superupplösningsmikroskopi genom en ny justering. De belade glastäckglaset som en del av provbäraren med skräddarsydda biokompatibla nanoark som skapar en spegeleffekt. Denna metod visar att lokalisering av enskilda sändare framför en metall-dielektrisk beläggning leder till högre precision, ljusstyrka och kontrast i Single Molecule Localization Microscopy (SMLM). Studien publicerades i Natur tidning Ljus:Vetenskap och tillämpningar .

Skärpan hos ett ljusmikroskop begränsas av fysiska förhållanden – strukturer som är närmare varandra än 0,2 tusendelar av en millimeter oskärpa, och kan inte längre skiljas från varandra. Orsaken till denna suddighet är diffraktion. Varje punktformat objekt visas därför inte som en punkt, men som en suddig plats.

Med matematiska metoder, upplösningen kan fortfarande förbättras drastiskt. En metod skulle beräkna dess exakta centrum från ljusstyrkefördelningen av den suddiga fläcken. Dock, det fungerar bara om två nära intilliggande punkter på objektet till en början inte är samtidigt men sedan är synliga, och slås samman senare i bildbehandlingen. Denna tidsmässiga avkoppling förhindrar överlagring av den suddiga fläcken. I åratal, forskare inom biovetenskap har använt denna knepiga metod för superhögupplöst ljusmikroskopi av celler.

En sådan metod utvecklades av professor Dr. Markus Sauers forskargrupp vid universitetet i Würzburg:direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM). Denna kraftfulla SMLM-teknik kan ge en sidoupplösning på ~ 20 nm. För det här syftet, vissa strukturer, till exempel, porer i en cellkärna, är färgade med fluorescerande färgämnen. Var och en av färgämnesmolekylerna blinkar med oregelbundna intervall och representerar en del av poren. Bilden av kärnporerna är därför initialt inte synlig, men uppstår efter bildbehandlingen genom överlagring av flera tusen bilder. Med dSTORM-tekniken, upplösningen för ett konventionellt ljusmikroskop kan ökas med en faktor 10. "Det gör att vi kan visualisera en cells arkitektur ner till dess molekylära nivå, till exempel, " förklarar Hannah Heil. Forskaren doktorerar vid Rudolf Virchow Center vid universitetet i Würzburg i gruppen av prof. Katrin Heinze.

Dock, fotonstatistiken definierar en virtuell upplösningsgräns i upplösning. För att lösa detta problem, Katrin Heinze hade idén att använda relativt enkla biokompatibla nanobeläggningar för att öka signalen. I ett gemensamt arbete med Markus Sauer och kollegor från Fysiska fakulteten, Hannah Heil designade och tillverkade metall-dielektriska nanobeläggningar som beter sig som en inställbar spegel. Det fördubblar nästan upplösningen.

Spegel, spegel på väggen:Vilken bild är skarpast av dem alla?

Under observationen, de placerade cellerna på ett ångavsatt täckglas med en tunn reflekterande nanobeläggning bestående av silver och transparent kiselnitrit. Beläggningen är biokompatibel, så det skadar inte cellen. Med denna metod, de två grupperna uppnådde två effekter:Spegeln reflekterade ljuset som sänds ut till mikroskopet, vilket ökade ljusstyrkan på fluorescenssignalen och därmed också den effektiva bildskärpan.

Andra, de emitterade och de reflekterade ljusvågorna överlagras. Detta skapar så kallad interferens. Beroende på avståndet till spegeln, ljuset förstärks eller dämpas. "På det här sättet, vi ser främst strukturer i ett visst bildplan, " säger Heil. "Allt som är över eller under och kan möjligen störa bilden är, å andra sidan, dold." För att säkerställa att de exakta delarna av bilden blir synliga, tjockleken på det genomskinliga skiktet som appliceras på spegeln måste väljas på lämpligt sätt. Bland annat, Heinze och Heil använder datorsimuleringar för att skräddarsy beläggningen efter objektet.

Övergripande, metoden är förvånansvärt enkel att använda, säger Hannah Heil. "Det är vad jag verkligen gillar med vårt tillvägagångssätt." Prof. Heinze tillägger, "Förutom det billiga metall-dielektriska täckglaset finns det inget behov av ytterligare mikroskophårdvara eller mjukvara för att öka lokaliseringsprecisionen, och är därför ett fantastiskt tillägg inom avancerad mikroskopi."