Schematisk bild av hybridmikroskopisystemet som innehåller ett delsystem för optoakustisk mikroskopi med dubbel våglängd vid 488 nm och 808 nm, saminriktad med ett delsystem för multiphotonmikroskopi vid 1043 nm. a) AMP -förstärkare, CCD-ljusfältskamera, DAQ -datainsamlingskort, DM dikroisk spegel, GC galvanometrisk spegelkontroll, IQD IQ demodulator, LO1 lokal oscillator 1, LO2 lokal oscillator 2, NDF -filter med neutral densitet, OA optoakustisk, OF optiskt filter, PC persondator, PH -hål, PMT fotomultiplikatorrör, SHG andra harmoniska generation, THG tredje harmoniska generation, TPEF två-foton excitationsfluorescens, xyz motoriserade steg. b) Spektrumet för excitations- och detektionsvåglängderna vid hybrid -FDOM/multiphoton (MP) -avbildning. c) Schematisk jämförelse mellan tidsdomän (TD) optoakustisk mikroskopi, som använder korta ljuspulser, och frekvensdomän (FD) optoakustisk mikroskopi, som är baserad på laserintensitet modulerad vid flera diskreta frekvenser. Kreditera: Ljus:Vetenskap och applikationer . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Optoakustisk avbildning som drivs av korta skurar av kontinuerliga våg (CW) lasrar kan stimulera utsläpp av ultraljudsvågor inuti ett djur eller hos människor. Metoden kan icke-invasivt fånga blodflödet och producera 3D-bilder av cellulär mikroarkitektur. Skriver in Ljus:Vetenskap och applikationer , Stephan Kellnberger och kollegor vid Institute of Biological and Medical Imaging, rapportera nu möjligheten att få optokoustiska bilder i hög kvalitet med kostnadseffektiva lasrar som styrs vid flera frekvenser.
Författarna demonstrerade experimentellt multipelfrekvensbaserade, bildbild av hög trovärdighet av biologisk arkitektur genom avbildning av mikrovaskulatur för fisk och musvävnad. I avbildningsexperimenten, de överlagrade strukturella detaljer som bara uppträdde vid specifika frekvenser av intresse. Författarna identifierade också icke-invasivt hastigheten på blodflödet i vävnadsmikrovaskulatur genom att spåra frekvensskiften med hjälp av den optoakustiska dopplereffekten.
Optoakustisk (fotoakustisk) avkänning kräver vanligtvis komplex laserteknik. Sådana tekniker kan generera nanosekundlängd (1-100 ns), kortenergipulser med hög energi som konventionellt belyser övergående (kortlivad) energi i tidsområdet (TD). De ultrakorta pulserna kan stimulera utsläpp av ultraljudsvågor med bredband, samlas i mikrosekundområdet för att bilda optoakustiska bilder. Dock, komplex laserteknik kan införa en lågpulsrepetitionsfrekvens (PRF) och begränsa antalet våglängder samtidigt tillgängliga för spektralavbildning. För att undvika sådana gränser, Kellnberger et al. utvecklat frekvensdomän optoakustisk mikroskopi (FDOM), där ljusintensiteten kan styras eller moduleras vid flera diskreta frekvenser med kostnadseffektiv hårdvara.
Förklaring av frekvenskodning i dubbel våglängd FDOM. a) Förenklat schema över frekvenskodning på olika våglängder. Laserkälla 1 som avger vid λ1 =488 nm laddades med den lägsta moduleringsfrekvensen f1, medan laserkälla 2 som avger vid λ2 =808 nm laddades med den högsta moduleringsfrekvensskärmen. Under avbildning, vi ökade moduleringen av våglängden λ1 och minskade moduleringsfrekvensen för λ2 i steg om fstep med udda antal moduleringsfrekvenser. b) Schematisk representation av flera moduleringsfrekvenser som används för bildbehandling, visar överlagring av frekvenser vid två våglängder. Kreditera: Ljus:Vetenskap och applikationer . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Än så länge, optoakustisk avbildning har bara förlitat sig på tekniker som detekterar signaler i tidsdomänen (TD) eller de som bara skannar en enda frekvens vid en eller två våglängder i frekvensdomänen (FD). Föreliggande studie var den första som utförde in vivo optoakustisk avbildning i en djurmodell via samtidig belysning med två våglängder.
Forskarna kombinerade FDOM till ett hybridsystem för att undersöka sambandet mellan bildbildning och frekvenskontroll. Användning av diskreta frekvenser (högst nio), tillät icke-invasiva optoakustiska Doppler-skiftmätningar som flödesobservationer i en mikrofluidisk flödeskammare i labbet först, och i vävnadsmikrovaskulatur in vivo därefter. I studien, Kellnberger et al. använde två CW -diodlasrar som avger ljus vid 488 nm och 808 nm för belysning.
Forskarna implementerade FDOM, arbetar inom frekvensområdet 5-50 MHz, som ett hybridsystem med multiphoton (MP) mikroskopi som arbetar vid 1043 nm. De utförde sedan två-/tredimensionell avbildning baserad på ultraljudsamplitud och fasmätningar vid flera frekvenser. Amplituden och fasen hos de genererade optoakustiska signalerna löstes via demodulering i realtid och spelades in med en analog-till-digital-omvandlare. På grund av höga repetitionsfrekvenser, FDOM uppnådde höga signal / brusförhållanden (SNR), vilket leder till de observerade högupplösta bilderna. Totalt, studien undersökte sambandet mellan moduleringsfrekvensen, bildtrohet och signal-brus-förhållandet (SNR).
FDOM-avbildning med en våglängd av en sutur och ex vivo zebrafiskprover. a) En schematisk illustration av skanning av två korsande suturer. b) Färgkodade FDOM-bilder av två 50 µm suturer, baserat på belysning vid 488 nm och modulationsfrekvenser på 10, 20, 30, och 40 MHz. Färgfrekvens-rymdrepresentationen (FSR) överlagrar bidragen av varje moduleringsfrekvens. Den gråskala FSR -bilden baserad på fyra frekvenser visar den slutliga bilden. c) Tvärsnittsprofil för den streckade linjen som visas i panel b, som jämför kontrasterna som avslöjas av de olika moduleringsfrekvenserna. d) Ex vivo -avbildning av en zebrafisklarvögla. Den lila bilden rekonstruerades med låga (L) frekvenser (10, 15, och 20 MHz); den gröna bilden med mellersta (M) frekvenser (25, 30, och 35 MHz); och den röda bilden med höga (H) frekvenser (40, 45, och 50 MHz). Den färgkodade överläggningen för alla frekvenser (FSR, 10 till 50 MHz) belyser bidraget från varje spektralregion. e) Orange färg visar amplitudsumman för de nio använda moduleringsfrekvenserna. f) En ljusfältbild av ett zebrafisköga, validering av FDOM -bildernas trohet. g) En jämförelse av signal-brus-förhållanden (SNR) av bilder av två korsande suturer (40 µm diameter) erhållna via FD och TD optoakustisk mikroskopi. FDOM -bilden gav en SNR på ~ 35 dB. h) Under liknande experimentella inställningar, TD -mikroskopi resulterade i en SNR på ~ 29 dB. Kreditera: Ljus:Vetenskap och applikationer . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
För att identifiera egenskaperna hos FD fotoakustisk avbildning, forskarna avbildade ett par korsade suturer i vatten vid två våglängder (488 nm och 808 nm) och diskreta moduleringsfrekvenser. Superpositionen av olika frekvensbidrag bar information om det avbildade objektet (suturer).
För att extrahera information från mer komplexa strukturer, Kellnberger et al. avbildat ögat på 5 dagar gammal vildtyp Zebrafisk lava ex vivo, med nio moduleringsfrekvenser som sträcker sig över 10-50 MHz i steg på 5 MHz. Forskarna jämförde också SNR (signal-brusförhållande) mellan FDOM-metoden och konventionell TD, som varierade beroende på experimentella parametrar (laserenergi, energiförbrukning och datainsamlingshårdvara).
Multifrekvensamplitud och fasdata kan således bearbetas för 3D-bildrekonstruktion med hjälp av en Fourier-transform baserad på frekvens-rymdrepresentation (FSR) och tids-rymdrepresentation (TSR). Jämfört med TSR, den FSR -baserade bildrekonstruktionen var beräkningsmässigt snabbare och krävde inte datainversion under bildrekonstruktion.
En- och dubbelvåglängd FDOM-avbildning av ett musörör in vivo. a) FDOM -avbildning vid 488 nm. Cyan färg representerar den rekonstruerade bilden, från nio lika fördelade frekvenser i intervallet 10 till 50 MHz. b – d) Enskilda bilder erhållna vid moduleringsfrekvenser på 10, 30, och 50 MHz, som visar strukturerna i den streckade rutan i panel a. e) SNR som en funktion av n frekvenser som användes för FSR -rekonstruktion. En asymptotisk förbättring observeras för n> 8 diskreta frekvenser. f) En profilvy av den streckade rutan i panel a, som avgränsas av en vit streckad pil. Det visar sambandet mellan moduleringsfrekvens och bildupplösning. Gula kors markerar bildupplösningen som en funktion av moduleringsfrekvensen:snabbare modulering (50 MHz) kan tydligt lösa små strukturer, till och med upp till 4 µm, medan långsammare modulering (10 MHz) inte kan. g – l) Hybrid FDOM/multiphoton avbildning av ett musör efter injektion av melanomceller. g) En överlagringsbild som erhölls med fyra etikettfria mikroskopimetoder:FDOM vid 488 nm och 808 nm, SHG vid 522 nm, och THG vid 348 nm. h) En ljusfältbild som validerar resultaten som erhölls via hybridmikroskopi; MC, melanomceller. i) FDOM -avbildning vid 488 nm som visar kärl- och melanomceller. j) En FDOM -bild vid 808 nm som visar B16F10 -melanomceller injicerade i musörat. k) En SHG -bild som visar kollagenfördelningen i överhuden. l) En THG -bild som visar vävnadsmorfologin; främst keratinocyter och hårsäckar. Kreditera: Ljus:Vetenskap och applikationer . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
För FDOM-baserad in vivo vävnadsavbildning, forskarna observerade örat av en bedövad mus. De erhöll artefaktfria bilder med flera moduleringsfrekvenser som matchade rumsliga frekvenser för det avbildade objektet. Forskarna använde högst nio frekvenser i studien. Bildens SNR ökade från ~ 14 dB vid en enda frekvens till ~ 30 dB vid nio frekvenser för skarpare bilder.
De observerade sedan ett musör som innehåller murina metastatiska melanomceller in vivo som tidigare via synkroniserad excitation av två våglängder (488 nm och 808 nm) vid separata moduleringsfrekvenser. Med hjälp av kombinerad optoakustisk och optisk mikroskopi, Kellnberger och medarbetare kunde effektivt avbilda vävnadsfunktionerna (dvs. kärl, melanomceller, kollagen och keratinocyter) utan konventionella fluorescerande taggar eller etiketter.
Kellnberger et al. utförde sedan FD micro-Doppler (µDoppler) mätningar med installationen för första gången i ett musör för optoakustisk avbildning av mikrocirkulationsblodflöde in vivo. Innan de avsedda mätningarna utförs, forskarna använde svarta kolpartiklar vid varierande flödeshastigheter i ett mikrofluidiskt chip för att validera den experimentella inställningen. ΜDoppler FDOM användes för att sedan generera en karta över mikrocirkulation i ett musör. Mikrocirkulationsblodflödet avslöjade gradvis ökande hastighet från kärlkanten till kärnan.
Optoakustisk avbildning av mikrocirkulationsblodflöde i musörat in vivo. a Ett schema för µDoppler-detekteringsinställningen. FL1− flöde 1 bort från den amerikanska sensorn, FL2− flöde 2 bort från den amerikanska sensorn (FL2−
På det här sättet, studien visade användning av frekvensdomän optoakustisk mikroskopi (FDOM) baserad signal detektering och demodulering för första gången. Forskarna fångade signaler av amplitud och fas vid flera frekvenser av det avbildade objektet. Den kollektiva experimentella uppsättningen innehöll billiga ljuskällor, samtidig belysning av flera våglängder och direkta dopplerbaserade flödesmätningar. I framtida studier, Kellnberger et al. kommer att kvantifiera moduleringsfrekvenserna, bilddjupet och öka bildupplösningen med hjälp av en förbättrad experimentell inställning.
© 2019 Science X Network
