Visualisera strukturen av virus, proteiner och andra små biomolekyler kan hjälpa forskare att få djupare insikter i hur dessa molekyler fungerar, potentiellt leda till nya behandlingar för sjukdomar. Under de senaste åren har en kraftfull teknik som kallas kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM), där snabbfrysta prover är inbäddade i glasliknande is och sonderas av en elektronstråle, har revolutionerat biomolekylavbildning. Dock, mikroskopen som tekniken förlitar sig på är oöverkomligt dyra och komplicerade att använda, gör dem otillgängliga för många forskare.

Nu, forskare från Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University (OIST) har utvecklat ett billigare och mer användarvänligt kryoelektronmikroskop, vilket i slutändan kan sätta cryo-EM inom räckhåll för tusentals labb.

I en sexårig byggprocess, teamet byggde mikroskopet genom att lägga till en ny avbildningsfunktion till ett svepelektronmikroskop. De använde hybridmikroskopet för att avbilda tre olika biomolekyler:två distinkt formade virus och ett daggmaskprotein.

"Att bygga detta mikroskop var en lång och utmanande process, så vi är glada över resultatet så här långt, " sa Dr Hidehito Adaniya, en forskare vid Quantum Wave Microscopy (QWM) Unit och medförfattare till studien, publicerad i Ultramikroskopi . "Förutom att det är billigare och enklare att använda, vårt mikroskop använder lågenergielektroner, vilket potentiellt skulle kunna förbättra kontrasten i bilderna."

För närvarande, cryo-EM fungerar genom att skjuta högenergielektroner mot ett biologiskt prov. Elektronerna interagerar med atomer i biomolekylen och sprider, ändrar sin riktning. De spridda elektronerna träffade sedan detektorer, och det specifika spridningsmönstret används för att bygga upp en bild av provet.

Men vid höga energier, endast ett relativt litet antal av dessa spridningshändelser inträffar eftersom elektronerna interagerar mycket svagt med atomerna i provet när de rusar förbi.

"Biomolekyler är till övervägande del sammansatta av element med låg atommassa, som kol, kväve, väte och syre, " förklarade medförfattare och forskare, Dr Martin Cheung. "Dessa lättare element är praktiskt taget osynliga för höghastighetselektroner."

I kontrast, lågenergielektroner färdas långsammare och interagerar starkare med de lättare elementen, skapa mer frekventa spridningshändelser.

Denna starka interaktion mellan lågenergielektroner och lättare element är utmanande att utnyttja, dock, eftersom islagret som omger provet också sprider elektroner, skapar bakgrundsljud som maskerar biomolekylerna. För att övervinna detta problem, forskarna anpassade mikroskopet så att det kunde byta till en annan bildteknik:kryoelektronholografi.

Bildar hologrammet

I holografiskt läge, en elektronpistol avfyrar en stråle av lågenergielektroner mot provet så att en del av elektronstrålen passerar genom isen och provet, bildar en objektvåg, medan den andra delen av elektronstrålen bara passerar genom isen, bildar en referensvåg. De två delarna av elektronstrålen interagerar sedan med varandra, som kolliderande krusningar i en damm, skapar ett distinkt mönster av interferens – hologrammet.

Baserat på hologrammets interferensmönster, detektorerna kan skilja spridning av provet från spridning av isfilmen. Forskare kan också jämföra de två delarna av strålen för att få extra information från elektronerna som är svår att upptäcka med konventionell kryo-EM.

"Elektronholografi ger oss två olika typer av information - amplitud och fas - medan konventionella kryoelektronmikroskopitekniker bara kan detektera fas, " sa Dr. Adaniya. Denna tillagda information skulle kunna göra det möjligt för forskare att få mer kunskap om strukturen på provet, han förklarade.

Ett genombrott i tunn is

Förutom att bygga hybridmikroskopet, forskarna var också tvungna att optimera provberedningen. Eftersom lågenergielektroner är mer benägna att spridas av isen än högenergielektroner, isfilmen som omsluter provet måste vara så tunn som möjligt för att maximera signalen. Forskarna använde flingor av hydratiserad grafenoxid för att hålla biomolekylerna på plats, tillåta tunnare isfilmer att bildas.

Forskarna var också tvungna att vidta särskilda åtgärder för att förhindra bildandet av kristallin is, vilket är "dåliga nyheter för cryo-EM-avbildning, " sa Cheung.

Med nuvarande inställning och optimerade prover, mikroskopet producerade bilder med en upplösning på upp till några nanometer, som forskarna erkänner är mycket lägre än den nära atomära upplösningen som uppnås med konventionell kryo-EM.

Men även med den nuvarande resolutionen, mikroskopet fyller fortfarande en viktig nisch som ett förscreeningsmikroskop. "Eftersom lågenergielektronerna interagerar så starkt med isen, vårt billigare och användarvänliga mikroskop kan hjälpa forskare att mäta deras iskvalitet innan de spenderar värdefull tid och pengar på att använda konventionella kryo-EM-mikroskop, " sa Dr Adaniya.

Hela processen är snabb och enkel, säger forskarna. SEM/STEM-läget hjälper forskare att hitta den bästa platsen för avbildning, följt av en sömlös övergång till holografiskt läge. Vad mer, förmågan för denna lägesväxlingsteknologi att implementeras i andra kommersiella svepelektronmikroskop gör den till en allmänt användbar avbildningsmetod.

I framtiden, teamet hoppas kunna förbättra bildupplösningen ytterligare, genom att byta elektronkanon till en som skapar en elektronstråle av högre kvalitet. "Det blir nästa steg framåt, " sa de.