Ett ultraexakt mikroskop som överträffar begränsningarna för Nobelprisvinnande superupplösningsmikroskopi kommer att låta forskare direkt mäta avstånd mellan enskilda molekyler.

UNSW medicinska forskare har uppnått oöverträffade upplösningsförmåga i enmolekylmikroskopi för att upptäcka interaktioner mellan enskilda molekyler i intakta celler.

2014 års Nobelpris i kemi delades ut för utvecklingen av superupplöst fluorescensmikroskopiteknik som gav mikroskopister den första molekylära synen inuti celler, en förmåga som har gett nya molekylära perspektiv på komplexa biologiska system och processer.

Nu har gränsen för detektion av enmolekylmikroskop krossats igen, och detaljerna publiceras i det aktuella numret av Vetenskapliga framsteg .

Medan enskilda molekyler redan kunde observeras och spåras med superupplösningsmikroskopi, interaktioner mellan dessa molekyler sker i en skala som är minst fyra gånger mindre än den som löses upp av befintliga enmolekylmikroskop.

"Anledningen till att lokaliseringsprecisionen för enmolekylära mikroskop är cirka 20-30 nanometer normalt är att mikroskopet faktiskt rör sig medan vi upptäcker den signalen. Detta leder till en osäkerhet. Med de befintliga superupplösningsinstrumenten, vi kan inte säga om ett protein är bundet till ett annat protein eller inte eftersom avståndet mellan dem är kortare än osäkerheten om deras positioner, säger Scientia-professor Katharina Gaus, forskargruppsledare och chef för UNSW Medicines EMBL Australia Node in Single Molecule Science.

För att kringgå detta problem, teamet byggde autonoma återkopplingsslingor inuti ett mikroskop med en enda molekyl som detekterar och justerar om den optiska vägen och scenen.

"Det spelar ingen roll vad du gör med det här mikroskopet, den hittar i princip tillbaka med precision under en nanometer. Det är ett smart mikroskop. Den gör allt som en operatör eller en servicetekniker behöver göra, och det gör det 12 gånger per sekund, säger professor Gaus.

Mätning av avståndet mellan proteiner

Med designen och metoderna som beskrivs i tidningen, återkopplingssystemet som designats av UNSW -teamet är kompatibelt med befintliga mikroskop och ger maximal flexibilitet för provberedning.

"Det är en riktigt enkel och elegant lösning på ett stort bildproblem. Vi har precis byggt ett mikroskop i ett mikroskop, och allt det gör är att rikta in huvudmikroskopet. Att lösningen vi hittade är enkel och praktisk är en verklig styrka eftersom den skulle möjliggöra enkel kloning av systemet, och snabbt utnyttjande av den nya tekniken, säger professor Gaus.

För att demonstrera användbarheten av deras ultraexakta återkopplingsmikroskop med en molekyl, forskarna använde den för att utföra direkta avståndsmätningar mellan signalproteiner i T-celler. En populär hypotes inom cellulär immunologi är att dessa immunceller förblir i viloläge när T-cellsreceptorn är bredvid en annan molekyl som fungerar som en broms.

Deras högprecisionsmikroskop kunde visa att dessa två signalmolekyler faktiskt är ytterligare separerade från varandra i aktiverade T-celler, släpper bromsen och sätter på T-cellsreceptorsignalering.

"Konventionella mikroskopitekniker skulle inte kunna mäta en så liten förändring exakt som avståndet mellan dessa signalmolekyler i vilande T -celler och i aktiverade T -celler endast skiljer sig med 4-7 nanometer, säger professor Gaus.

"Detta visar också hur känsliga dessa signaleringsmaskiner är för rumslig segregation. För att identifiera regulatoriska processer som dessa, vi måste utföra exakta avståndsmätningar, och det är vad detta mikroskop möjliggör. Dessa resultat illustrerar potentialen hos denna teknik för upptäckter som inte kunde göras på något annat sätt."

Postdoktor, Dr Simao Pereira Coelho, tillsammans med Ph.D. student Jongho Baek — som sedan dess har tilldelats sin doktorsexamen. examen – ledde designen, utveckling, och byggandet av detta system. Dr. Baek mottog också Dean's Award for Outstanding Ph.D. Examensarbete för detta arbete.