Forskare vid EPFL har utvecklat robusta och lättimplementerade flerfärgsbilder med superupplösning. Tillvägagångssättet är baserat på det samtidiga förvärvet av två spektrala kanaler följt av spektral korskumulantanalys och avblandning. De utnyttjar fluoroforblinkning och spektral överhörning för generering av ytterligare färgkanaler med superupplösta bilder.

Flerfärgsfluorescensmikroskopi är ett viktigt verktyg för biovetenskaperna för att studera de relativa arrangemangen av cellulära strukturer eller interaktioner mellan olika proteiner. Dock, konventionella mikroskop, arbetshästarna för många biologiska studier, kan bara lösa detaljer i ordningen för ljusets våglängd. Under de senaste två decennierna, flera superupplösningsmikroskopikoncept hjälpte forskare att övervinna denna diffraktionsgräns och att göra nya upptäckter. Dessa nya metoder hittar bara långsamt sin väg till rutinmässiga biologiska tillämpningar. För några av de nya teknikerna, detta beror på komplicerad mikroskophårdvara, men också ökade krav på provberedning och fluorescerande märkningar utgör betydande hinder. Kraven för framgångsrik superupplösningsavbildning är ännu mer utmanande att uppfylla för flerfärgsapplikationer.

EPFL:s laboratorium för biomedicinsk optik under ledning av Theo Lasser har arbetat mycket med Super-resolution Optical Fluctuation Imaging (SOFI) för att öka den rumsliga upplösningen och samplingen i 2-D och 3-D. SOFI är ett alternativ till Single-Moecule Localization Microscopy-tekniker som STORM och PALM. Den analyserar högre ordnings spatio-temporal statistik för en tidsserie av blinkande fluoroforer och kräver inte isolering av individuella fluoroforers emissioner. SOFI är kompatibel med ett bredare utbud av märknings- och bildbehandlingsförhållanden, vilket förenklar fluoroforval och experiment. I deras nya studie, forskare vid School of Engineering ledd av Theo Lasser och Aleksandra Radenovic (chef för Laboratory of Nanoscale Biology) utökade den statistiska analysen till den spektrala domänen för att bana väg mot ett nytt tillvägagångssätt för multicolor super-resolution imaging.

Antalet färger begränsas inte av mikroskopets spektrala kanaler eller utnyttjande av spektral överhörning

Tanken bakom SOFI-metoden i flera färger är följande. Vid klassisk flerfärgsavbildning bör överhörning mellan olika spektrala kanaler i mikroskopet undvikas. Här, forskarna utnyttjar överhörningen för att generera ytterligare färgkanaler. De tillämpar korskumulant analys mellan flera samtidigt förvärvade spektrala kanaler. Den statistiska analysen tillåter dem att komplettera de fysiska detektionskanalerna som tillhandahålls av mikroskopet med ytterligare virtuella spektrala kanaler. "Endast de signaler som är spatialt och tidsmässigt korrelerade i de olika spektrala kanalerna kommer att dyka upp i de virtuella kanalerna. Vi plockar upp exakt den överhörning som alla andra vill bli av med." förklarar Kristin Grußmayer, en av studiens huvudförfattare. De ytterligare beräkningsgenererade spektralkanalerna tillsammans med linjär avblandning möjliggör avbildning av mer distinkta fluoroforfärger än inspelade fysiska detektionskanaler.

Publikationen ger teorin bakom spektral korskumulant multicolor SOFI och inkluderar ett ramverk för att optimera mikroskopets spektrala kanaler för en given kombination av fluoroforer som bör avbildas. Simulerade datauppsättningar hjälpte teamet att verifiera att deras nya flerfärgsmetod skulle fungera för ett brett utbud av etiketter med olika fotofysiska egenskaper, även för dem med starkt överlappande emissionsspektra. "Vi skulle kunna visa att vårt tillvägagångssätt fungerar för trefärgsavbildning i fasta och i levande celler för en mängd olika färgämnen och fluorescerande proteiner. Avbildningen kan utföras med kommersiella bredfältsuppställningar med tvåkanaliga bilddelningsenheter som är allmänt tillgängliga. I princip , vi är inte begränsade till 3 färger." säger Kristin Grußmayer.

Instruktioner för att utföra flerfärgsspektral korskumulant SOFI-analys finns på webbsidan för Laboratory of Nanoscale biology under www.epfl.ch/labs/lben/sofi-packages/ och mjukvarupaketet kan laddas ner på www.epfl.ch/ labs/lben/wp-content/uploads /2020/05/multicolor_sofi_v2.3.zip .