Fluorescensmikroskopi används ofta inom biokemi och biovetenskap eftersom det gör det möjligt för forskare att direkt observera celler och vissa föreningar i och runt dem. Fluorescerande molekyler absorberar ljus inom ett specifikt våglängdsområde och sänder sedan ut det på nytt vid det längre våglängdsområdet. Dock, den största begränsningen för konventionella fluorescensmikroskopitekniker är att resultaten är mycket svåra att utvärdera kvantitativt; fluorescensintensiteten påverkas signifikant av både experimentella förhållanden och koncentrationen av det fluorescerande ämnet. Nu, en ny studie av forskare från Japan kommer att revolutionera området för fluorescenslivstidsmikroskopi.

En väg runt det konventionella problemet är att fokusera på fluorescenslivslängd istället för intensitet. När ett fluorescerande ämne bestrålas med en kort ljusskur, den resulterande fluorescensen försvinner inte omedelbart utan "sönderfaller" faktiskt över tiden på ett sätt som är specifikt för ämnet. Tekniken för fluorescenslivstidsmikroskopi utnyttjar detta fenomen, som är oberoende av experimentella förhållanden, att kvantifiera fluorescerande molekyler och förändringar i deras miljö. Dock, fluorescenssönderfall är extremt snabbt, och vanliga kameror kan inte fånga den. Medan en enpunkts fotodetektor kan användas istället, den måste skannas genom hela provets område för att kunna rekonstruera en komplett 2D-bild från varje uppmätt punkt. Denna process involverar förflyttning av mekaniska delar, vilket i hög grad begränsar bildtagningshastigheten.

I denna senaste studie, publiceras i Vetenskapliga framsteg , forskarteamet utvecklade ett nytt tillvägagångssätt för att ta fluorescensbilder utan behov av mekanisk skanning. Professor Takeshi Yasui, från Institute of Post-LED Photonics (pLED), Tokushima University, Japan, som ledde studien, säger, "Vår metod kan tolkas som att samtidigt kartlägga 44, 400 ljusbaserade "stoppur" över ett 2-D-utrymme för att mäta fluorescenslivstider-allt i ett enda skott och utan skanning. "

En av huvudpelarna i deras metod är användningen av en optisk frekvenskam som excitationsljus för provet. En optisk frekvenskam är i huvudsak en ljussignal som består av summan av många diskreta optiska frekvenser med ett konstant avstånd mellan dem. Ordet "kam" hänvisar i detta sammanhang till hur signalen ser ut när den plottas mot optisk frekvens:ett tätt kluster av lika långa spikar som stiger från den optiska frekvensaxeln och liknar en hårkam. Använda speciell optisk utrustning, ett par excitationsfrekvenskamsignaler sönderdelas till individuella optiska beatsignaler (dual-comb optiska beats) med olika intensitetsmodulationsfrekvenser, var och en bär en enda moduleringsfrekvens och bestrålas på målprovet. Nyckeln här är att varje ljusstråle träffar provet på en rumsligt distinkt plats, skapa en en-till-en-överensstämmelse mellan varje punkt på 2D-ytan av samplet (pixel) och varje moduleringsfrekvens för de dubbelkammiga optiska slagen.

På grund av dess fluorescensegenskaper, provet återutsänder en del av den infångade strålningen samtidigt som frekvens-positionsöverensstämmelsen bevaras. Fluorescensen som emitteras från provet fokuseras sedan helt enkelt med hjälp av en lins på en höghastighets enpunktsfotodetektor. Till sist, den uppmätta signalen omvandlas matematiskt till frekvensdomänen, och fluorescenslivslängden vid varje "pixel" beräknas lätt från den relativa fasfördröjning som finns mellan excitationssignalen vid den moduleringsfrekvensen kontra den uppmätta.

Tack vare sin överlägsna hastighet och höga rumsliga upplösning, mikroskopimetoden som utvecklats i denna studie kommer att göra det lättare att utnyttja fördelarna med fluorescenslivstidsmätningar. "Eftersom vår teknik inte kräver skanning, en samtidig mätning över hela provet garanteras i varje skott, "säger prof. Yasui, "Detta kommer att vara till hjälp inom biovetenskap där dynamiska observationer av levande celler behövs." Förutom att ge djupare insikt i biologiska processer, denna nya metod skulle kunna användas för samtidig avbildning av flera prover för antigentestning, som redan används för diagnos av covid-19.

Kanske viktigast av allt, denna studie visar hur optiska frekvenskammar, som bara användes som "frekvenslinjaler, " kan hitta en plats inom mikroskopitekniker för att driva på höljet inom biovetenskap. Det lovar utvecklingen av nya terapeutiska alternativ för att behandla svårbehandlade sjukdomar och öka den förväntade livslängden, och därmed gynna hela mänskligheten.