En forskargrupp ledd av Takashi Saito, vid Ehime University Graduate School of Medicine, utvecklat ett 2-foton excitationsljusark fluorescensmikroskop som (1) sänker fototoxiciteten, (2) utökar synfältet, och (3) ökar den rumsliga upplösningen. Detta mikroskop, när den används för observation av medaka fisk, gjorde det möjligt att observera hela embryots kropp (ett utökat synfält) vid en cellulär upplösning (hög rumslig upplösning) utan att påverka fiskens tillväxt (låg fototoxicitet) under en tre dagars embryonal utveckling. Detta resultat publicerades i den vetenskapliga tidskriften Naturkommunikation .

Fluorescensmikroskopet används i stor utsträckning inom biovetenskapen för att observera molekyler inuti en cell på ett icke-invasivt sätt. Light-sheet fluorescensmikroskopi gör det möjligt att spela in tredimensionella bilder med hög insamlingshastighet och hög rumslig upplösning. Dock, i konventionella ljusarkmikroskop, det är svårt att begränsa fotoskador på levande vävnader, och även svårt att samtidigt uppnå bred FOV och hög (cellnivå) rumslig upplösning.

Utveckling av en två-foton excitation vid fält, ljusarkmikroskop

Ehime University forskargrupp av Takashi Saitou, Sota Takanezawa, och Takeshi Imamura använde tvåfotonexcitationsfenomenet som en nyckel för att lösa detta problem. Två-foton-excitationsmikroskopet med infraröda lasrar möjliggör skonsam (lågt fototoxisk) avbildning av levande organismer. Dock, eftersom ljuset måste fokuseras på ett smalt område för att inducera två-foton excitation, excitationsområdet (i ljusarkmikroskop, synfältet) är smalt. För att lösa detta, forskarna utvecklade en enkel belysningsoptikenhet med en Bessel-stråle som utökar laserns utbredningsområde i den optiska axelns riktning (Fig. 1A). Den här enheten kan sträcka strållängden till 600-1000 μm samtidigt som den bibehåller en axiell upplösning på 2-3 μm vid användning av en 10x förstoring NA0.3 objektiv. Med denna optiska enhet, de konstruerade en tvåfotonexcitationsljusarkmikroskopi (Fig. 1B), vilket gör det möjligt att utföra helkroppsavbildning av medaka-larver med cellulär upplösning (Fig. 1C).

Medaka används ofta som modellorganism för ryggradsdjur. Den är lämplig för fluorescerande avbildning eftersom den är liten och transparent. För att utvärdera tillämpligheten av mikroskopet för användning på levande organismer, forskarna gjorde en fototoxicitetsbedömning. Detta avslöjade minskad fotoskada jämfört med det konventionella gaussiska ljusarkmikroskopet. Det föreslås därför vara lämpligt för långvarig levande avbildning. Forskarna tillämpade sedan långvarig time-lapse-avbildning av den transgena medaka där lymfatiska endotelet är märkt med grönt fluorescerande protein, och lyckades med levande avbildning under tre dagar med fem minuters intervall (fig. 2).

I den här studien, forskarna utvecklade ett nytt högpresterande fluorescensmikroskop för ljusark. Genom att använda denna teknik, forskare kan observera nästan alla embryonala tillväxtprocesser hos medakafiskar med hög cellupplösning över hela fiskens kropp. Denna teknik förväntas bidra till förståelsen av embryonal utveckling på molekylär nivå, klarläggandet av patogenes för livsstilsrelaterade sjukdomar, och att främja tekniken för läkemedelsutveckling.