När forskare behövde visualisera strukturen av spikproteinet, som coronavirus använder för att infiltrera mänskliga celler, de övergick till kryo-elektronmikroskopi. Ett av de mest kraftfulla bildverktygen i en forskares arsenal, kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) kan visualisera proteiner, patogener och olika cellkomponenter nästan ner till sina individuella atomer.

Men att förbereda prover för cryo-EM är en besvärlig process som är beroende av etan - ett kraftfullt kylmedel i flytande form, och en brandfarlig gas vid rumstemperatur utsatt för explosioner.

En ny studie publicerad 7 september i International Union of Crystallography Journal visar att cryo-EM-prover kan framställas med ett säkrare och billigare kylmedel – flytande kväve – och dessa prover kan ge ännu skarpare bilder än de som framställts med etan. Fynden upphäver konventionell visdom som går tillbaka till 1980-talet, och kan förbättra säkerheten och kvaliteten på cryo-EM.

"Etan är inte en standardlabbkemikalie. Det är farligt, och att använda det ger ytterligare komplikationer, " sa seniorförfattaren Robert Thorne, professor i fysik vid College of Arts and Sciences och en Weiss Presidential Fellow. "Flytande kväve är det bästa kylmedlet."

Cryo-EM fungerar genom att avfyra elektroner genom molekyler som är snabbfrysta i en glasartad vattenskiva, fånga flera suddiga bilder av molekylerna i isen. Sofistikerad programvara kan ofta snitta de suddiga klippen till en skarp 3D-bild, men inte konsekvent.

En del av suddigheten kommer från själva provet. När vattnet som omsluter molekylerna kyls för långsamt, det bildar iskristaller som försämrar bilden. Forskare kringgår detta problem genom att använda etan för att kyla vattnet så snabbt att det snäpper till en glasartad, kristallfritt ark. Men en sådan snabb frysning sätter stress på arket, som vilar på en tunn hinna av guld. När elektronstrålen träffar arket, stress får molekylerna att röra sig, gör den slutliga bilden suddig i ett fenomen som kallas strålinducerad rörelse.

"Vi har två motsatta faktorer, " sa Thorne. "Vi vill kyla proverna snabbt, för att förhindra iskristallbildning och för att fånga molekylernas biologiska struktur. Men vi vill också kyla proverna så långsamt som möjligt för att minimera deras rörelse under avbildning."

Etan kyler prover mycket snabbt. Men forskare måste använda flytande kväve för att omvandla etangas till en vätska, och sedan mer flytande kväve för att lagra prover efter att de har frysts. "Etan är besvärligt, det är farligt, och, i sista hand, proverna hamnar ändå i flytande kväve, sa Thorne.

Flytande kväve kyls med hastigheter som är ungefär 50 gånger långsammare än etans, enligt rapporter under de senaste 40 åren, och det är inte tillräckligt snabbt för att omvandla vatten till ett glasartat ark. Men 2006 Thornes forskargrupp upptäckte att den huvudsakliga faktorn som bromsade kvävet var kall gas som svävade ovanför vätskans yta, som kylde små prover innan de någonsin kom till vätskan.

Thornes företag, MiTeGen, utvecklade så småningom ett automatiserat kylinstrument för röntgenkristallografi - en annan metod som används för att avbilda proteinmolekyler - som tar bort den kalla gasen precis innan ett prov sänks ner i kväve, och fann att kylningshastigheterna ökade till bara sex gånger långsammare än etan. MiTeGen-personal anpassade sedan sitt kylinstrument för kryo-EM-prover och samarbetade med personal vid Cornell Center for Materials Research och postdoktor Jonathan Clinger för att samla in och analysera kryo-EM-data.

Som den nya studien rapporterar, kväve kyls med perfekt hastighet för beredning av cryo-EM-prov — tillräckligt snabbt för att undvika betydande iskristallbildning, men långsam nog för att minska strålinducerad rörelse senare.

"Etan är överkill, " sa Thorne. "För snabbhet behöver du inte, du får suddiga bilder med strålinducerad rörelse, och det är mer problematiskt än några iskristaller som bildas från något långsammare kylning."

Och kylning av helt flytande kväve, Thorne sa, kommer att förenkla cryo-EM-arbetsflöden, ta bort de extra stegen som krävs av etan och göra det lättare att designa automatiserade kylinstrument som uppfyller gällande labbsäkerhetsstandarder.

"Detta är en bra illustration av hur grundläggande akademisk vetenskap - att titta på hur små föremål svalnar och hur is bildas inom dem - kan leda till praktiska lösningar och kommersiella produkter."