(Phys.org) — Genom att ladda något specifikt protein och nukleinsyra i en icosahedrisk fag T4 kapsidbaserad nanopartikel, den resulterande celltillförselvehikelns ligander kan binda till ytan av specifika målvävnader för att leverera protein/DNA-lasten. (Icosaedriska virala nanopartiklar är evolutionära proteinskal sammansatta i en hierarkisk ordning som resulterar i ett stabilt proteinlager och ett inre utrymme för att hysa nukleinsyror och proteiner; en kapsid är ett viruss proteinskal.) Tekniken har läkemedels- och gen- leveransapplikationer vid mänskliga sjukdomar, diagnostisk och cellulär avbildning, och andra medicinska områden. Nyligen, forskare vid US Naval Research Laboratory, Washington, DC och University of Maryland i Baltimore förpackade T4-nanopartiklar in vivo med aktiv cyklisk rekombination, eller Cre, rekombinas (ett genetiskt rekombinationsenzym som används för att manipulera genomstruktur och kontrollera genuttryck) och in vitro med fluorescerande mCherry (ett fluorescerande protein som används som markör när det är taggat till molekyler och cellkomponenter) expressionsplasmid-DNA, och levererade dessa nanopartiklar till cancerceller:När de släpptes in i celler i närvaro av både DNA och protein, rekombinaset ökar mCherry-uttrycket genom cirkularisering (det vill säga ändra det förpackade linjära DNA:t till en cirkulär slinga). Forskarna konstaterar att denna effektiva och specifika förpackning till kapsider och uppackning av både DNA och protein med frisättning av de enzymatiskt förändrade protein-/DNA-komplexen från nanopartiklarna till celler har potential i många nedströmsapplikationer såsom genetisk och cancerterapi.

Dr Jinny L. Liu diskuterade uppsatsen att hon, Prof. Lindsay W. Black och deras medförfattare publicerade i Proceedings of the National Academy of Sciences USA . "Icosaedriska virala nanopartiklar är i huvudsak 100 nm gånger 80 nm nanobehållare som gör att exogent genetiskt material kan förpackas in vitro genom nukleinsyramaskineri som i allmänhet endast tillåter linjärt DNA/RNA att paketeras genom en portalkanal, " berättar Liu Phys.org . "Dock, in vitro proteinförpackningar är i allmänhet omöjligt, eftersom det för de flesta virala nanopartiklar inte finns något proteinförpackningsmaskineri som är jämförbart med nukleinsyraförpackningsmaskiner." Även om protein kan vara kemiskt tvärbundet till kapsidens inre yta, detta förväntas leda till proteindenaturering och förlust av enzymatisk aktivitet.

Med det sagt, naturen har utvecklat lösningar på detta problem med proteinförpackningar. Under in vivo viral kapsidmontering, Liu förklarar, vissa bakteriella virus, eller bakteriofager, målproteiner inom prokapsiderna innan nukleinsyran är förpackad för att skjuta ut proteinerna med nukleinsyran, därigenom underlättar infektion i samband med nukleinsyran. (En procapsid, eller prohead, är en omogen viral kapsidstruktur som bildas i de tidiga stadierna av självmontering av vissa bakteriofager. Produktion och montering av stabila proheads är en viktig föregångare till bakteriofaggenomförpackning.) Endast ett fåtal fager har välkarakteriserade in vivo proteinförpackningssystem, och fag T4 är bäst karakteriserad. "Prof. Blacks labb vid UMB och mitt labb vid NRL har visat att inte bara ett specifikt främmande enzym – cykliskt rekombinations (Cre) rekombinas – kan packas in i kapsiden in vivo , men också att den är aktiv i kapsiden." Denna aktivitet demonstrerades genom att visa religeringen (återförenandet av två DNA-strängar eller andra molekyler genom en fosfatesterbindning) av förpackat linjärt DNA flankerat med två Cre-rekombinationsställen.

Uppsatsen visar att det betydande utrymmet i en T4-nanobehållare rymmer det aktiva Cre-enzymet tillsammans med exogent DNA. "För potentiella tillämpningar, T4 kan paketera upp till 50 kb exogent linjärt DNA innehållande önskade gener i full längd tillsammans med rekombinaser, antingen Cre eller λ-röda proteiner, för specifik homolog rekombination inom kromosomen, " noterar Liu. ( Homolog rekombination är en typ av genetisk rekombination där nukleotidsekvenser utbyts mellan två liknande eller identiska molekyler av DNA.) "Vi förväntar oss att cas9-enzymet skulle kunna inkapslas på ett jämförbart sätt - och faktiskt, minst åtta olika proteiner har inkapslats på detta sätt. Genom homolog rekombination, vårt system kan tillåta att den korrigerade genen ersätter den muterade genen på sin ursprungliga plats i kromosomen eller genom att exakt slå ut de överaktiva generna i stamceller." Liu påpekar att T4-leveransvektorn är säkrare och bättre kontrollerad än andra virala leveransgener terapi, såsom de som levererar gener med användning av infektiösa djurvirusvektorer för att slumpmässigt infoga genen i kromosomen.

I deras tidning, författarna rapporterar att T4-kapsid-NP-genuttrycket och proteinleveranssystemet kan vara komplementärt till eller användas i samband med genterapi baserad på RNA Cas och taranukleas. (Cas-gener kodar för proteiner relaterade till DNA-loci som innehåller korta upprepningar av bassekvenser kända som Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, eller CRISPRs.) "T4 nanopartikeluttryckssystemet kan enkelt komplettera Cas9 och taran nukleasbaserad rekombination genom att paketera det linjära cas9, mål-sgRNA-plasmid-DNA, och Cre-rekombinas – eller till och med ligas, ett enzym som underlättar sammanfogningen av DNA-strängar – och levererar de resulterande T4-nanopartiklarna in i de mottagande eukaryota cellerna med hög specificitet med användning av SOC och HOC, " berättar Liu Phys.org . (SOC och HOC är dispenserbara T4-kapsidproteiner.) "Genom att visa målsökande ligander (bindande molekyler) på ytan, T4 -kapsidgenuttrycket och proteinsystemet kommer att effektivt kunna leverera Cas9- och sgRNA -plasmiderna tillsammans till de önskade mottagarcellerna. Relevanta enzymatiskt aktiva proteiner Cas9, lambda exonukleas, lambda beta-protein och andra kan levereras direkt samtidigt från T4-nanopartikeln."

Liu tillägger att hennes labb också har studerat cellavbildning och läkemedel/genleverans till eukaryota celler med hjälp av T4 svanslösa nanopartiklar, som forskarna visade kan komma in i de eukaryota cellerna utan att orsaka celldöd.

Ett specifikt exempel på potentiella nedströms läkemedels- och genterapeutiska tillämpningar som härrör från det nya tillvägagångssättet är leverans av det toxiska proteinet och linjär plasmid som producerar neutraliserande peptider eller antikroppar i riktade cancerceller som visar specifika cancermarkörer som använder högaffinitets SOC + HOC -markörbindande proteiner på ytan av kapsiderna, medan ett annat exempel är att använda systemet för HIV-genterapi.

Liu tillägger att det finns flera vägar för att använda detta system för genterapi:

• Leverera T4-nanopartiklar förpackade med rekombinas (eller ligas) och linjär plasmid-DNA för att producera gp120 eller interferon för att generera eller öka immunsvaret hos patienter
• Levererar T4-nanopartiklar förpackade med rekombinas (ligas) och den linjärt lösliga CD40-expressionsplasmiden DNA till T-lymfocyter eller hematopoetiska celler för att blockera infektionen av HIV-1
• Hämmar RNA genom att leverera det konstruerade plasmid-DNA som kan producera lock-RNA för att binda virussens DNA
• Hämmar protein genom att leverera förpackade antivirala antikroppar och anti-HIV-antikroppsplasmid-DNA

Förutom diagnostisk och cellulär avbildning, T4 nanopartikelgen-proteinsystemet kan leverera reparerade gener för att korrigera mänskliga genetiska sjukdomar – till exempel, reversering av adenosindeaminas (ADA)-brist genom att introducera protein-DNA-komplexet för att uttrycka ADA i stamceller. Andra breda forskningsområden som påverkas av genterapiteknologier, såsom genetiska defekter, cancer, neurologiska sjukdomar hos vuxna, och åldrandet i sig, kan också dra nytta av denna studie.

Går vidare, forskarna vill utveckla fler T4-prokapsider som packar exonukleas och andra rekombinaser tillsammans med konstruerat mål-DNA för att visa att de resulterande T4-kapsiderna kan infoga genen i en stamcellslinje med en genetisk brist. "Dessutom, " avslutar Liu, "vi arbetar med att anpassa vårt system för att leverera terapeutiska peptider eller antikroppar till celler som utsätts för eller infekteras av biothreat -medel, som proteingifter eller virus, effektiv neutralisering av toxineffekter. Behandlingen och botandet av celler och vävnader som exponeras för sådana medel är av stort intresse för vår forskningsgemenskap om bioförsvar."

© 2014 Phys.org