Forskare från Columbia University, med kollegor på Genia Technologies (Roche), Harvard University och National Institute of Standards and Technology (NIST) rapporterar att man uppnår elektronisk DNA-sekvensering av enstaka molekyler i realtid vid enkelbasupplösning med hjälp av en protein nanopore-array.

DNA-sekvensering är nyckelteknologin för personliga och precisionsmedicinska initiativ, möjliggör snabba upptäckter inom biomedicinsk vetenskap. En individs fullständiga genomsekvens ger viktiga markörer och riktlinjer för medicinsk diagnostik, sjukvård, och upprätthålla ett hälsosamt liv. Hittills, kostnaden och hastigheten för att få fram mycket exakta DNA-sekvenser har varit en stor utmaning. Även om olika framsteg har gjorts under det senaste decenniet, de högkapacitetssekvenseringsinstrument som används i stor utsträckning idag är beroende av optik för detektering av fyra DNA-byggstenar:A, C, G och T. För att utforska alternativa mätmöjligheter, elektronisk sekvensering av en ensemble av DNA-mallar har utvecklats för genetisk analys. Nanopore-strängsekvensering, varvid ett enkelsträngat DNA träs genom porerna i nanoskala under en pålagd elektrisk spänning för att producera elektroniska signaler för sekvensbestämning på enstaka molekylnivå, har nyligen utvecklats; dock, eftersom de fyra nukleotiderna är väldigt lika i sina kemiska strukturer, de kan inte lätt urskiljas med denna metod. Forskare satsar därför aktivt på forskning och utveckling av en exakt elektronisk DNA-sekvenseringsplattform med en enda molekyl eftersom den har potential att producera en miniatyriserad DNA-sekvenserare som kan dechiffrera genomet för att underlätta personlig precisionsmedicin.

Ett team av forskare vid Columbia Engineering, leds av Jingyue Ju (Samuel Ruben-Peter G. Viele professor i teknik, Professor i kemiteknik och farmakologi, chef för Center for Genome Technology &Biomolecular Engineering), med kollegor vid Harvard Medical School, ledd av George Church (professor i genetik); Genia Technologies, ledd av Stefan Roever (VD för Genia); och John Kasianowicz, chefsutredare på NIST, har utvecklat ett komplett system för att sekvensera DNA i nanoporer elektroniskt på singelmolekylnivå med singelbasupplösning. Detta jobb, berättigad, "Elektronisk DNA-sekvensering av en molekyl i realtid genom syntes med hjälp av polymermärkta nukleotider på en Nanopore-array, " publiceras i tidskriften, Proceedings of the National Academy of Sciences ( PNAS ) Tidig upplaga.

Tidigare, forskare från laboratorierna Ju i Columbia och Kasianowicz vid NIST rapporterade den allmänna principen för nanoporesekvensering genom syntes (SBS), genomförbarheten av design och syntes av polymermärkta nukleotider som substrat för DNA-polymeras, detektionen och differentieringen av polymertaggarna genom nanopore på enkelmolekylnivå [ Vetenskapliga rapporter 2, 684 (2012) DOI:10.1038/srep00684]. Nuvarande PNAS papper beskriver konstruktionen av det kompletta nanopore SBS-systemet för att producera elektroniska sekvenseringsdata för en enda molekyl med enkelbasupplösning. Denna SBS-strategi skiljer exakt fyra DNA-baser genom att elektroniskt detektera och differentiera fyra olika polymertaggar fästa vid 5'-fosfatet av nukleotiderna under deras inkorporering i en växande DNA-sträng katalyserad av polymeras, ett DNA-syntetiserande enzym. Forskarna designade och syntetiserade nya nukleotider taggade vid det terminala fosfatet med oligonukleotidbaserade polymerer för att utföra nanopore SBS på en α-hemolysinprotein nanopore array-plattform. Taggarna på de polymermärkta nukleotiderna, som verifierades vara aktiva substrat för DNA-polymeras, producera olika blockadnivåer för elektrisk ström. De konstruerade en nanopore-array på ett elektroniskt chip med flera elektroder; arrayen är sammansatt av proteinkanaler som kopplades till ett DNA-polymeras som var bundet till en primad DNA-mall. Tillägg av distinkta specialdesignade polymermärkta nukleotider till nanopore-arrayen utlöser DNA-syntes. Genom att blockera kanalens jonström till olika nivåer, de distinkta taggarna ger en avläsning av mallsekvensen i realtid med enkelbasupplösning.

Som Carl Fuller, huvud författare, Adjungerad seniorforskare vid Ju-laboratoriet vid avdelningen för kemiteknik i Columbia och chef för kemi på Genia, pekar ut, "Nyheten i vår nanopore SBS-metod börjar med designen, syntes, och urval av fyra olika polymermärkta nukleotider. Vi använder ett DNA-polymeras kovalent fäst till nanoporen och de taggade nukleotiderna för att utföra SBS. Under replikering av DNA bundet till polymeraset, taggen för varje komplementär nukleotid fångas i poren för att producera en unik elektrisk signal. Fyra distinkta polymertaggar som ger distinkta signaturer som känns igen av den elektroniska detektorn i nanopore-arraychipset används för sekvensbestämning. Således, DNA-sekvenser erhålls för många enstaka molekyler parallellt och i realtid. De fyra polymertaggarna är designade för att ge mycket bättre skillnader sinsemellan, i motsats till de små skillnaderna mellan de fyra nativa DNA-nukleotiderna, och därigenom övervinna den stora utmaningen som andra direkta nanopore-sekvenseringsmetoder står inför." Dessutom, taggarna kan optimeras ytterligare med avseende på storlek, avgift, och struktur för att ge optimal upplösning i nanopore SBS-systemet.

"Detta spännande projekt samlar forskare och ingenjörer från både akademi och industri med kombinerad expertis inom molekylär ingenjörsteknik, nanoteknik, genomik, elektronik och datavetenskap för att producera revolutionerande, kostnadseffektiva genetiska diagnostiska plattformar med oöverträffad potential för precisionsmedicin, " säger Ju. "Vi är oerhört tacksamma för det generösa stödet från NIH som gjorde det möjligt för oss att göra snabba framsteg i forskning och utveckling av nanopore SBS-teknologin, och de enastående bidragen från alla medlemmar i vårt forskningskonsortium."

Enligt Ju, forskarna har redan drivit bortom vad som visades i PNAS studie där sekvenseringsdata erhölls på en tidig prototypsekvenserare baserad på nanopore SBS. Genomströmningen och prestandan för den nuvarande sequencern har utvecklats utöver vad som rapporterades i PNAS papper. Möjligheten att nå läslängder på över 1000 baser av DNA har nyligen uppnåtts. Går framåt, det samarbetande forskarteamet kommer att fortsätta att optimera taggarna genom att justera länkarna, strukturera, och laddning på molekylär nivå, och finjustera polymeraset och elektroniken för nanopore SBS-systemet med målet att exakt sekvensera ett helt mänskligt genom snabbt och till låg kostnad, vilket gör att den kan användas vid rutinmässiga medicinska diagnoser.