Nematocyster är stickande organeller från cnidarians som har anmärkningsvärda mekaniska egenskaper för att genomgå 50-procentiga volymförändringar under explosiv exocytos (process genom vilken celler utsöndrar avfall och stora molekyler), samtidigt som det tål osmotiskt tryck över 100 bar. Forskare hade nyligen identifierat två nya proteinkomponenter som byggde upp nematocystväggen i Hydra för att inkludera (1) ett cnidarian prolinrikt protein-1 (CPP-1) med ett stelt polyprolinmotiv, och (2) ett elastiskt Cnidoin som har en silkesliknande domän. I en ny studie, nu på Vetenskapliga rapporter , Theresa Bentele och ett team av forskare vid institutionerna för medicin, Molecular Evolution and Genomics och Institute of Physical Chemistry i Tyskland, Australien och Japan, uttryckt rekombinanta Cnidoin- och CPP-1-proteiner i Escherichia coli .

De jämförde elasticitetsmodulen för spontant tvärbundna bulkproteiner med den för isolerade nematocyster. Forskarna optimerade systematiskt tillverkningen av enhetliga protein -nanofibrer med hjälp av elektrospinning och förberedande förhållanden. Båda fibrerna förblev stabila även efter noggrann tvättning och nedsänkning i bulkvatten, på grund av samtidig tvärbindning av cysteinrika domäner. De resulterande nanofibrerna skilde sig klart från andra protein -nanofibrer som var instabila utan kemiska tvärbindningsförfaranden. Efter kvantitativ bedömning av mekaniska egenskaper, de undersökte tillämpningar av Cnidoin och CPP-1 nanofibrer för att främja tillväxten av mänskliga mesenkymala stamceller.

Hydra nematocyster omfattar fyra varianter som utvecklas i kroppskolonnen av polyper i specialiserade celler som kallas nematocyter. Den enastående mekaniska segheten hos kapselväggstrukturen gör nematocyster unika för att bilda bioinspirerade material i labbet. Kapseln innehåller proteinkomplex tvärbundna av intermolekylära disulfidbindningar mellan cysteinrika domäner (CRD), som kan användas som en mångsidig tvärbindare för att skapa linjära eller grenade polymerer bland olika proteiner. Forskarna hade redan identifierat två nya kapselproteiner inklusive CPP-1 och Cnidoin medan de studerade Hydra nematocyster i sitt tidigare arbete. Potentialen att kombinera elastiskt Cnidoin och stela CPP-1-proteiner var en lovande strategi för att designa nya biomaterial som kan bilda stabila strukturer med spontan tvärbindning för att realisera enastående flexibilitet och seghet, liknande biologiska nematocystkapslar. Syntetiska bioinspirerade proteinnanofibrer har fått ökad uppmärksamhet som en artificiell matris för att odla stamceller för vävnadstekniska tillämpningar. Elektrospinning erbjuder en vanlig metod att tillverka sådana fibrer med hjälp av silkesproteiner, kollagen och gelatin. De tunna fiberprodukterna har flera tillämpningar inom sårläkning och vävnadsteknik.

I detta arbete, Bentele et al. introducerade en ny klass av syntetiska tvärbindningsfria nanofibrer baserade på Hydra nematocystproteinerna CPP-1 och Cnidoin med hjälp av elektrospinning. Baserat på den spontana tvärbindningskapaciteten hos CRD:er optimerade de systematiskt de förberedande förhållandena för att biokonstruera tvärbindningsfria proteinnanofibrer som är stabila under vatten med potentiella tillämpningar för human stamcellskultur. Forskargruppen fick representativa immunfluorescensbilder av en Hydra konjugerad med CPP-1 (grön) och Cnidoin (röd) antikroppar för att samlokalisera proteinerna i kapselväggen. Bilderna indikerade närvaron av Cnidoin som tätare packad inom mogna nematocystväggar jämfört med CPP-1. Därefter, Bentele et al. använde Western blot-metoder för att identifiera de isolerade naturliga nematocystkapslarna och rekombinanta proteiner (proteiner uttryckta i andra organismer); som de producerade i E. coli. Resultaten indikerade betydande post-translationella modifieringar av CPP-1 i Hydra. De bekräftade resultaten med användning av CPP-1-proteinet uttryckt i E. coli och härledde att både CPP-1 och Cnidoin var strukturella proteiner i nematocystväggen integrerade under bildning eller morfogenes.

Forskarna testade sedan de mekaniska egenskaperna hos Hydra nematocyster och bulkproteiner med hjälp av svepelektronmikroskopi (SEM) och atomkraftsmikroskopi (AFM). Forskarna extraherade fördelningen av de elastiska modulerna och mätte vidare elasticiteten hos renat rekombinant CPP-1 (reCPP-1) och Cnidoin (reCnidoin) uttryckt i E. coli. De optimerade sedan nanofiberproduktionen genom att introducera polyetylenglykol (PEG) 900 kDa till den rena lösningen för att få högre viskositet hos produkten. Teamet undersökte påverkan av relativ luftfuktighet – vilket avsevärt påverkade kvaliteten på nanofibrer, medan jonstyrkan eller konduktiviteten hos spinnlösningar inte visade något inflytande på nanofibrerna.

Baserat på de preliminära materialutvecklings- och karakteriseringsresultaten, Bentele et al. tillverkade protein-nanofibrer genom elektrospinning av protein-PEG-lösningen på täckglas. De nysvunna recCPP-1-PEG nanofibrerna visade en enhetlig bredd och höjd över en 50 x 50 µm ² område och uppvisade en enhetlig elasticitetsmodul. Teamet mätte sedan ytopografi, erhållit en elasticitetskarta och en karakteristisk kraft-indragningskurva för reCPP-1 och reCnidoin nanofibrer (a) i luft, (b) i luft efter tvätt med vatten, och i (c) fysiologisk buffertlösning. De kunde ta bort PEG genom att tvätta med vatten för att få en avsevärt minskad fibertjocklek för reCnidoin nanofibrer, även om dimensionerna var mindre uttalade jämfört med reCPP-1 efter vattenbehandling.

Dock, fibrerna löste sig inte helt efter tvätt med vatten och behöll sin elasticitetsmodul. Resultaten tyder på att de två rekombinanta proteinerna kan etablera stabila nanofibrer genom att spontant bilda disulfidbindningar mellan CRD (cystein-rich-domain) terminaler. De rekombinanta Hydra nematocystproteinerna som produceras i detta arbete bildade också enhetliga och stabila nanofibrer genom naturligt förekommande CRDs i luft och i fysiologisk buffert. Teamet undersökte tillämpningarna av dessa nanofibrer med stabil human mesenkymal stamcellskultur under 20 dagars inkubation, under vilken cirka 95 procent av cellerna visade celltillväxt och livskraft på de nya bioinspirerade materialen.

På det här sättet, Theresa Bentele och kollegor föreslog ett nytt syntetiskt tvärbindningsfritt biomaterial av nanofiber, bioinspirerad av nematocystkapselproteinerna från Hydra. De uttryckte rekombinanta proteiner av två nyligen identifierade CPP-1 och Cnidoin nematocyst kapselproteiner inom E. coli och preparerade nanofibrer via elektrospinning. Som ett resultat av de cysteinrika domänerna (CRD), de elektrospunna fibrerna kan spontant tvärbinda via disulfidbindningar. De rekombinanta proteinerna reCPP-1 och reCnidoin bildade enhetliga nanofibrer som var stabila i vatten direkt efter elektrospinning. De nya materialkonstruktionerna visade potential som biokompatibla material inspirerade av den tuffa och elastiska Hydra nematocyststrukturen.

© 2019 Science X Network