Forskare har designat och syntetiserat kedjor av molekyler med en exakt sekvens och längd för att effektivt skydda 3-D DNA-nanostrukturer från strukturell nedbrytning under en mängd olika biomedicinskt relevanta förhållanden. De demonstrerade hur dessa "peptoidbelagda DNA-origami" har potential att användas för att leverera läkemedel och proteiner mot cancer. avbildning av biologiska molekyler, och riktar sig mot cellytereceptorer som är inblandade i cancer. Deras metod för att designa peptoider för att stabilisera DNA-origami i fysiologiska miljöer beskrivs i en artikel publicerad i Förfaranden från National Academy of Sciences veckan den 9 mars.

I likhet med den japanska konsten att vika papper, DNA-origami är vikningen av långa, flexibla DNA-kedjor till önskade former i nanoskala (miljarddelar av en meter) genom att "häfta" olika delar av kedjan med de komplementära basparen av korta DNA-strängar. Dessa programmerbara och exakt kontrollerade nanoskalaarkitekturer kan vara fördelaktiga för många biomedicinska tillämpningar, inklusive riktad leverans av läkemedel och gener till önskade vävnader eller celler, avbildning av biologiska processer inuti kroppen, och biosensing för sjukdomsdetektering eller hälsoövervakning. Dock, för att möjliggöra sådana applikationer krävs lösningar för att skydda DNA -origamistrukturer i komplexa biologiska vätskor och möjliggöra nya funktioner som inte är inneboende i DNA.

"En av de begränsande faktorerna för att tillämpa struktur- och formfördelarna med DNA-origami på nanomedicin är att, placerad inuti människokroppen, DNA-nanostrukturen skulle lätt smältas av enzymer eller brytas ned som svar på förändringar i lösningens sammansättning eller pH-nivå, "förklarade författaren Shih-Ting (Christine) Wang, en postdoc i Soft and Bio Nanomaterials Group vid Center for Functional Nanomaterials (CFN) vid US Department of Energy's (DOE) Brookhaven National Laboratory. "I denna forskning, vi syntetiserade biokompatibla molekyler som kallas peptoider med en väldefinierad molekylsekvenssammansättning och längd. Vi belagde oktaedralt format DNA-origami-som har hög mekanisk stabilitet och ett stort öppet utrymme för att transportera nanoskala, som småmolekylära cancerläkemedel-med dessa peptoider. Våra demonstrationer visade att peptoidbeläggningarna effektivt skyddade DNA-origamin under olika fysiologiska förhållanden och stödde tillägget av olika kemiska funktioner för biomedicinska tillämpningar."

Peptoider liknar peptider, eller korta kedjor av aminosyror. Dock, i peptoider, sidokedjorna (kemiska grupper bundna till huvudkedjan eller ryggraden i molekylen) är bundna till kväve snarare än till kol. Dessutom, peptoider är mer flexibla, på grund av bristen på vätebindningar i ryggraden. Denna flexibilitet kan utnyttjas för att kontrollera hur peptoiderna binder till DNA -origami.

"Vårt mål var att göra en minimalistisk beläggning som inte skulle ge bulk till origamin men samtidigt vara tillräckligt effektiv för att erbjuda skydd, löslighet, och kompatibilitet med olika biofunktioner, "sade motsvarande författare Oleg Gang, ledare för CFN Soft and Bio Nanomaterials Group och professor i kemiteknik och tillämpad fysik och materialvetenskap vid Columbia Engineering. "Om den belagda origamin blir skrymmande, dess form och hur den interagerar med och rymmer andra biomolekyler och origami skulle påverkas, introducerar en mängd olika komplikationer. "

Wang och Gang, assisterad av en medarbetare från Imperial College London, använde anläggningar vid Lawrence Berkeley National Laboratory's Molecular Foundry (MF) för att syntetisera två typer av peptoidarkitekturer för att skydda DNA-origami:borsttyp och blocktyp. Båda arkitekturerna har en DNA-bindande domän (positivt laddad del som binder till negativt laddad DNA) och en vattenlöslig domän (del som säkerställer att DNA omges av vattenmolekyler, som krävs för stabilisering). Arkitekturen av penseltyp växlar mellan dessa två domäner, medan blocktypsarkitekturen grupperar dem för att bilda distinkta "block".

För att avgöra vilken typ som var bättre på att ge skydd, forskarna studerade bindningen mellan tvåsträngat (duplex) DNA och peptoider. Experiment med fluorescerande färgämne (som binder till DNA:t) visade att en specifik arkitektur av penseltyp var mest effektiv för att stabilisera duplex-DNA belagt med peptoider vid hög temperatur. En samarbetspartner vid RMIT University i Australien simulerade DNA-peptoid-interaktionerna på molekylär nivå för att förstå varför.

"Vi tror att den omväxlande strukturen uppnår en balans, genom att vissa bitar sitter i spåret i DNA-dubbelhelixstrukturen för att ge skydd, medan andra bitar sticker ut för att interagera positivt med vatten, ", sa Wang. "En optimal konfiguration är borsttypen med 12 DNA-bindande och 12 vattenlösliga grupper."

Styrs av dessa studier, teamet undersökte den strukturella stabiliteten hos den peptoidbelagda DNA-origamin i flera typer av fysiologiskt relevanta tillstånd:i en lösning innehållande en låg koncentration av positivt laddade magnesiumjoner (Mg), i en lösning som innehåller ett DNA-specifikt nukleas (typ av enzym), och inkuberas i cellodlingsmedia (innehållande både nukleaser och Mg-joner i låg koncentration). Vanligtvis, en hög Mg-jonkoncentration krävs för att stabilisera DNA-origami genom att minska avstötningen av DNA-DNA-negativa laddningar, men fysiologiska vätskor innehåller mycket lägre koncentrationer.

För sina undersökningar, de använde en kombination av experimentella tekniker:agarosgelelektrofores, en metod för att separera DNA -fragment (eller andra makromolekyler) på grundval av deras laddning och storlek; transmissionselektronmikroskopi avbildning och dynamisk ljusspridning vid CFN; och realtids röntgenspridning med liten vinkel vid Life Science X-ray Scattering (LiX) strållinjen för Brookhavens National Synchrotron Light Source II (NSLS-II). Resultaten indikerade att origamins struktur hade förblivit intakt efter att den belagts med specifikt utformade peptoider och placerats under de olika fysiologiska förhållandena.

Efter dessa experiment, forskarna genomförde en serie demonstrationer i samarbete med Bertozzi Group vid Stanford University för att utforska hur den peptoidbelagda origamin kan användas i biomedicinska tillämpningar. Till exempel, de laddade kemoterapiläkemedlet doxorubicin i den belagda origamin. Doxorubicin är ett av de vanligaste läkemedlen till patienter med HER2-positiv bröstcancer, där ett överuttryck av HER2 -proteinet (en receptor på bröstceller) får celler att dela sig och växa okontrollerbart. Över 48 timmar, den belagda origamin frigjorde mindre av doxorubicinet än dess icke-belagda motsvarighet, mätt genom intensiteten av läkemedlets inneboende fluorescens.

"Det slutliga målet är att kunna modulera utsläppshastigheten under läkemedelsleveransprocessen för att kontrollera biologiska och toxiska effekter, " förklarade Wang.

I en andra demonstration av nanolast, de undersökte om proteiner kunde levereras på liknande sätt. De inkapslade ett ko-härledt protein (fäst vid fluorescerande molekyler för visualisering) inuti den belagda origamin i närvaro av det protein-smältande enzymet trypsin. Spjälkning av detta inkapslade protein av trypsin reducerades och bromsades på grund av en kombination av själva DNA-origamin och peptoidbeläggningen.

I en sista demonstration, de funktionaliserade ytan på den peptoidbelagda DNA-origamin med trastuzumab. Mer känd under varumärket Herceptin, trastuzumab är en antikropp som riktar sig till HER2 -receptorer. Vid bindning till dessa receptorer, trastuzumab blockerar cancercellerna från att ta emot de kemiska signaler de behöver för att växa. De uppnådde ytfunktionaliseringen genom att lägga till kemiska grupper till specifika platser på trastuzumab-molekylen och in i peptoidsekvenserna. Genom "klicka kemi, Dessa grupper reagerar selektivt för att bilda kovalenta bindningar (liknande att klicka på ett bältesspänne).

I uppföljande experiment, Wang planerar att utforska potentialen med kombinatorisk terapi, i vilken peptoidbelagd DNA-origami som bär doxorubicin och med en trastuzumab-funktionaliserad yta riktar sig mot HER2-positiva bröstcancerceller.

Wang tilldelades medel genom Brookhavens Technology Maturation Program för att vidareutveckla denna teknik på basis av en pitch som hon utvecklade som deltagare i den andra workshopen om entreprenörskap som anordnades av Brookhavens Office of Technology Transfer i april 2019. Brookhavens Intellectual Property Legal Group lämnade nyligen in en provisorisk patentansökan för peptoiddesignmetoden till US Patent and Trademark Office.

"Vi går nu in i översättningsstadiet, genomföra experiment med celler och eventuellt hela organismer, sa Gang.