Klockan 02.00 en natt i april i fjol, Michael Schoof trippelkollade siffrorna på sin skärm, tog ett djupt andetag, och avfyrade ett mejl som han hade väntat hela dagen på att skicka.

"Jag tror att det fungerar" var den försiktiga formuleringen i hans meddelande.

Schoof, en doktorand i Peter Walters labb, Ph.D., en känd forskare specialiserad på proteinsortering och cellulära membran, var en del av ett litet team på ett quixotiskt uppdrag:att immobilisera SARS-CoV-2, det nya coronaviruset som orsakar covid, genom att använda en syntetisk version av små antikroppar som ursprungligen upptäcktes i lamadjur och kameler. Dessa "nanokroppar, "som de är kända, hade kommit från UC San Franciscos labb av Aashish Manglik, M.D., Ph.D., en blivande proteinforskare som hade ägnat de senaste tre åren åt att bygga ett stort bibliotek av nanokroppar och utveckla nya sätt att utnyttja deras ovanliga egenskaper.

Under föregående månad, Schoof hade tillbringat större delen av sina vakna timmar instängd i det annars tomma labbkomplexet på UCSF:s Mission Bay-campus. Det var höjden av covids uppsving på våren 2020, och endast nödvändig sjukvårdspersonal och de som arbetar med vetenskap relaterade till pandemin tilläts till universitetets lokaler. Schoof hade dragit sin rumskamrat, en medstudent vid namn Reuben Saunders, att arbeta med honom i projektet. livnär sig på ångade dumplings och liter te, de hade sorterat igenom de 2 miljarder nanokroppar i Mangliks bibliotek i hopp om att identifiera en molekyl som kunde glomma på den dödliga SARS-CoV-2 och immobilisera den. Nu, till sist, Schoof var övertygad om att de hade uppnått sitt första stora genombrott.

Det första steget i en virusinfektion är en cellkapning. För att få kontroll över en mänsklig cell, SARS-CoV-2 låser de grappling-krok-liknande spikarna på sin egen utsida till proteiner som kallas ACE2-receptorer på utsidan av en målcell. Men tänk om, undrade forskarna, de skulle kunna blockera kaparen genom att ge gripkrokarna något annat att haka fast i?

Den dagen, Schoof hade börjat köra tester på hundratals kolonier av jäst, var och en konstruerad för att producera vissa nanokroppar från Mangliks bibliotek. Alla dessa speciella nanokroppar hade visat en förmåga att haka fast vid SARS-CoV-2:s spikar. Nu var det dags att ställa nyckelfrågorna:Hur hårt hade dessa nanokroppar bundna till spikarna? Kunde de konkurrera med ACE2-receptorerna?

Att få reda på, Schoof hade blandat sina nanokroppsuttryckande jästceller med fluorescerande SARS-CoV-2 spikar. När han tittade på resultaten från de två första plattorna, han kände en ström av spänning, som han snabbt dämpade med den vetenskapliga skepticism han hade lärt sig att odla. Några av nanokropparna höll fast vid SARS-CoV-2-spikarna men kunde fortfarande armbågas åt sidan av ett överskott av mänskliga ACE2-receptorer:tydliga bevis på en potentiell neutralisator.

"Den där, " minns han, "det var när vi visste att vi hade något."

Under dagarna som följde Schoofs försiktiga e-postmeddelande på kvällen, Walter och Manglik utnyttjade sina respektive nätverk av vetenskapliga kontakter, kallar in förstärkningar från labb över campus och så långt bort som Paris för att hjälpa till i nästa steg av deras sökande. Snart, det lilla teamet hade förvandlats till en veritabel armé av tvärvetenskapliga forskare och doktorander. I november, de publicerade sina resultat i den prestigefyllda tidskriften Science. I tidningen, nästan 60 medförfattare beskrev en djärv, innovativ covid-motåtgärd, föreslår att deras nanokroppar skulle kunna användas på ett billigt, lätttransporterad nässpray som kan neutralisera SARS-CoV-2. Bland dem själva, de kallade molekylerna AeroNabs.

Sedan dess, UCSF-teamet har sökt en branschpartner som är villig att ta del av den kostsamma och rigorösa kliniska prövningsprocessen, men för närvarande är läkemedelsföretagen fokuserade på vaccinutveckling i förebyggande syfte och mer traditionella antikroppar för behandling.

Men nanobody-metoden är lovande. På grund av den enkla strukturen hos nanokroppar, AeroNabs kan vara mycket billigare och snabbare att masstillverka, mycket lättare att transportera, och mycket lättare att lagra än de traditionella antikropparna som för närvarande används och är under utveckling.

"Det här är något du kan ta efter att ha testat positivt som kan minska din virusmängd omedelbart, "Säger Walter. "Så dina chanser att utveckla en allvarlig sjukdom skulle minska med den här behandlingen."

Han noterar också att massvaccination kommer att ta tid, och att inte alla i befolkningen kan eller kommer att vaccineras, gör passivt skydd fortfarande otroligt värdefullt. "Och, " han lägger till, "vi vet inte hur brett vaccinet kommer att finnas tillgängligt utanför världens rikaste länder."

Dynamisk duo

Fröet till AeroNabs-projektet såddes 2017, när Walter hörde Manglik hålla ett föredrag om sitt arbete.

Vid första ögonkastet, de två forskarna verkar vara ett udda par. Med sitt fulla huvud av mörkt hår, pojkaktigt leende, och renrakad haka, Manglik kan misstas för en doktorand. Faktiskt, han är en stigande stjärna inom sitt område som 2013 gjorde Scientific American s "30 under 30"-lista. Född i Indien, Manglik tillbringade sina första åtta år i Saudiarabien innan hans familj immigrerade till Des Moines, Iowa, där han upptäckte vetenskapen på college. 60-talet Walter, å andra sidan, har ett helvitt skägg och mustasch och glasögon med små linser. Han föddes och växte upp i Tyskland, kom till USA för sitt examensarbete, och har kartlagt en legendarisk karriär. Hans många utmärkelser inkluderar det prestigefyllda Lasker Award, ofta ses som en föregångare till ett Nobelpris. Men trots deras olikheter, Walter och Manglik delar en djup passion för molekylärbiologi och dess oändligt flexibla organiska byggstenar:proteiner.

Mangliks tal den dagen handlade om hans ansträngning att samla ett av världens största bibliotek av nanokroppar – ett lovande, relativt ny typ av antikropp som härrör från blodet från lamadjur, kameler, och andra djur i kamelfamiljen. Han hade först lärt sig om nanokroppar på forskarskolan i Stanford, efter att ha blivit kär i studiet av receptorer, en bred familj av proteiner involverade i intercellulär signalering. Receptorer sticker ut ur celler som antenner, var och en svarar på en specifik kemisk signal. När man studerar mänskliga adrenalinreceptorer, Manglik använde i stor utsträckning nanokroppar, som, tack vare deras lilla storlek, kan interagera med receptorer med mycket mer precision än de skräddarsydda antikroppar han använde för att utforska receptoregenskaper. Hans experiment avslöjade hur olika geometriska konfigurationer av receptorer påverkar deras signalbeteende.

"Proteiner är inte bara enkla lego som passar ihop - de är som lego gjorda av gelé eller kitt, " Manglik förklarar. "De rör sig hela tiden. Faktiskt, det är rörelsen av ett protein, det visar sig, som verkligen spelar roll för hur det fungerar. Och nanokroppar kan hjälpa oss att kontrollera den rörelsen."

Nanobodies:En välsignelse för vetenskapen

Nanokroppar upptäcktes i slutet av 1980-talet av ett par studenter vid Fria universitetet i Bryssel, efter att de närmade sig sin biologiprofessor, en immunolog vid namn Raymond Hamers, att klaga på ett uppdrag. Historien har fördunklat orsaken till deras klagomål; en mycket citerad redogörelse hävdar att eleverna var oroliga för att uppdraget, vilket krävde att de analyserade antikropparna i mänskligt blod, kan infektera dem med en sjukdom. En annan version säger att eleverna tyckte att experimentet var tråkigt och bad sin professor att tilldela dem något mer originellt.

Oavsett sanning, ingen ifrågasätter vad som hände sedan. Rota runt i ett laboratoriekylskåp, Hamers hittade en flaska med fruset kamelserum från dromedar infekterat med parasiter som tros orsaka afrikansk sömnsjuka. Han gav den till eleverna och föreslog att de skulle isolera antikropparna i kamelblodet för att se hur de såg ut. När eleverna renade blodet, de upptäckte något fantastiskt.

Förutom de standardantikroppar som finns i alla ryggradsdjur, de renade proverna innehöll en derivat antikropp som aldrig tidigare setts inom vetenskapen – mindre, enklare proteiner, som eleverna först misstog för fragment av konventionella antikroppar. Ytterligare undersökning visade att de var en helt ny klass av immuna medel, saknar en av proteinkedjorna som finns i alla andra tidigare studerade antikroppar.

Upptäckten ledde till en banbrytande artikel från 1993 i den prestigefyllda tidskriften Natur . Hamers och hans elever kallade de nya diminutiva proteinerna nanobodies. Liknande enkelkedjiga antikroppar identifierades senare i lamor, alpackor, guanacos (ett annat långhalsat sydamerikanskt däggdjur), och till och med hajar.

Det blev snart uppenbart inte bara att nanokroppar var användbara immunologiskt, men att deras ringa storlek gjorde dem användbara experimentella verktyg – vilket Manglik och hans UCSF-kollegor mycket väl kan bekräfta.

Att studera hur dessa gelatinösa byggstenar på molekylnivå rör sig, knäpp och knäpp, och interagera blev Mangliks fokus när han började på UCSF-fakulteten. Han visste tidigt att nanokroppar skulle vara en stor del av hans arbete. Även om antikroppar och nanokroppar finns för att hjälpa djur att bekämpa infektioner, Manglik ser dem också som ett oändligt formbart verktyg som kan användas för att hacka sig in i ett brett spektrum av processer i människokroppen samt avkoda grundläggande vetenskapliga mysterier. Men nanokroppar var tidskrävande att tillverka och krävde tillgång till kamelider. Som doktorand, Manglik hade förlitat sig på en samarbetspartner i Belgien som skulle injicera ett intressant receptorprotein i en lama, skörda sedan nanokropparna från djurets blod. Hela processen tog månader av mycket specialiserat arbete, vilket endast ett fåtal grupper hade förmågan att göra.

Att demokratisera tillgången till nanokroppar för forskare överallt, Manglik slog sig ihop med Andrew Kruse, Ph.D., en nära vän från gymnasiet som hade gått på fakulteten vid Harvard Medical School. Tillsammans, de två labben skapade biljoner unika DNA-sekvenser som kodar för nanokroppar, var och en inspirerad av de nanokroppar som normalt finns inuti lamor. DNA-sekvenserna för dessa nanokroppar är inrymda i en stor pool av miljarder små jästceller, som var och en kan lockas till att sätta en kopia av en enskild nanokropp på dess yta. Helt kringgå behovet av en levande lama, ett sådant bibliotek ger forskare tillgång till jästceller som hyser nanokroppar som är specifika för en given uppgift. Manglik och Kruse har öppet delat sina bibliotek med hundratals labb runt om i världen.

"Tanken är att i ett djur, det finns biljoner olika nanokroppar att slåss mot allt som det kan stöta på, " säger han. "Vi ville göra ett bibliotek som kodade för miljarder individuella nanokroppar. Det här biblioteket skulle vara en bra utgångspunkt för att hitta en nanobody mot i princip vad som helst - allt i labbet och utan att behöva injicera ett djur."

Efter att ha hört Manglik förklara allt detta, Walter styrde sin doktorand Michael Schoof till Mangliks labb. Schoof försökte modulera beteendet hos ett protein relaterat till traumatisk hjärnskada, och Walter misstänkte att Mangliks nanokroppar kunde vara användbara i det arbetet.

Sedan slog coronaviruset till, världen stannade, och nästan all icke-COVID-relaterad verksamhet vid universitetet stängdes av.

"Så vid den tidpunkten, vi sa, "Väl, vi kan antingen sitta hemma nu, eller så kan vi fundera på hur vi verkligen kan hjälpa till i denna strävan efter en lösning, ", minns Walter.

Inom ett par dagar, Walter och Schoof hade e-postkontakt med Manglik. De kände till nanokropparnas sjukdomsbekämpande egenskaper. En nanobody-teknologi hade nyligen vunnit FDA-godkännande för att behandla en blodproppssjukdom, och ännu en, används för att behandla ett luftvägsvirus, hade nått sent stadium av kliniska prövningar.

Var det möjligt att de kunde bygga en för att bekämpa coronaviruset?

Ett fantastiskt resultat

Från början, laget visste, projektets framgång skulle vila på deras förmåga att hitta en nanobody med tillräcklig bindningsaffinitet – förmågan att fästa vid och tvångströja coronavirusets spikar.

Proteiner har specifika former. Hur väl två proteiner passar ihop avgör deras bindningsaffinitet. Walter och Manglik visste att den bindningsaffinitet som får SARS-CoV-2 att fästa vid ACE2-proteiner teoretiskt sett kunde övermannas av en nanokropp formad på precis rätt sätt.

Manglik hade redan en nyckelingrediens för ett sådant experiment. Forskare vid University of Texas (UT) i Austin hade nyligen avslöjat den unika strukturen hos SARS-CoV-2-spikarna som gjorde att viruset kunde binda till mänskliga cellers ACE2-receptorer. Manglik nådde ut till UT:s Jason McLellan, Ph.D., som gick med på att skicka honom sin "konstruktion" - en bit av DNA som kodar för spikarna som kan sättas in i en annan cell, uttryckt i stora mängder, renat, och används för experiment.

Teamet började screena de 2 miljarder nanokroppar i biblioteket för att se om de kunde hitta föreningar med rätt bindningsaffinitet till SARS-CoV-2-spikar. Inom tre veckor, de hade identifierat 800 potentiella kandidater, och en vecka senare skrev Schoof sitt försiktiga mejl sent på kvällen och informerade Manglik och Walter om att han hade sett några positiva resultat. I slutet av april, teamet hade identifierat 21 distinkta nanokroppar som verkade konkurrera med ACE2-receptorn, teoretiskt blockerar SARS-CoV-2-fästemekanismen.

Det var då det lilla laget började bli större, rekrytera strukturbiologer för att nollställa hur nanokropparna band till SARS-CoV-2 spikproteinet, och sedan använda denna information för att designa ändringar för att göra dem ännu mer kraftfulla.

Det krävde att rena 21 kandidatproteiner, testa deras bindning, och sedan använda UCSF:s kryoelektronmikroskopianläggningar för att avbilda de mest lovande kandidaterna i nära atomär upplösning, medan de var bundna till SARS-CoV-2-spiken. För att slutföra denna monumentala uppgift, de gick samman med en parallell ansträngning som kallas QCRG Structural Biology Consortium – en löpande-liknande process sammansatt av 12 UCSF-fakultetsmedlemmar och över 60 praktikanter för att ta itu med SARS-CoV-2. Ansträngningen drevs av en känsla av brådska, och deltagarna arbetade ansträngande timmar långt in på natten.

När teamet hade bilder av de bästa nanokropparna bundna till SARS-CoV-2-spiken, de började undersöka varje nanobodys unika bindningsmekanism och använde den informationen för att designa en nästa generations version. De bestämde sig för att konstruera en trearmad nanokropp som består av tre kopior av en enda nanokropp som sys ihop så att den samtidigt kunde binda till de tre separata armarna som utgör varje koronavirusspik.

Efter att ha sytt ihop nanokropparna och testat dem, Bryan Faust, en doktorand i Mangliks labb, levererade nästa spännande upptäckt:Var och en av de tre armarna förbättrade bindningen av sina grannar exponentiellt. Förmågan hos den förbättrade versionen att binda till de virala spikarna ökade tvåhundratusenfaldigt.

"Det här var ett fantastiskt resultat - att se denna enorma förbättringsordning, " minns Walter. "Det var absolut firande."

För att testa föreningen mot ett levande virus, teamet behövde ett laboratorium med en biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3) beteckning. Gruppen rekryterade Marco Vignuzzi, Ph.D., en före detta UCSF postdoc som driver ett BSL-3-labb vid Institut Pasteur i Paris. I juni, en av Vignuzzis postdoktorer körde UCSF nanobody mot faktisk SARS-CoV-2 för att se om den var kapabel att neutralisera viruset.

Slutresultatet var både mycket effektivt och stabilt - så stabilt att det kan levereras i aerosolform med en nätnebulisator som Manglik köpte på Amazon.

Med Big Pharma laserfokuserat på att utveckla vacciner och traditionella antikroppar, att hitta en snabb väg till kommersialisering har visat sig vara en utmaning. Men Manglik, Walter, och deras lag är oförskräckt.

"Det är nästan säkert att det kommer att bli fler andningspandemier under vår livstid, " säger Manglik. "Det kan vara influensa, ståndarknapp SARS-pandemi, eller någon patogen som vi inte ens känner till ännu. För nästa pandemi, förhoppningen är att forskare inte bara skulle kunna gå lika snabbt som vi gjorde, men kanske ännu snabbare."

Utan tvekan, det skulle vara svårt att hitta ett mer kraftfullt bevis på den förtjusande oförutsägbarheten och potentialen hos modern vetenskap – att en pandemi som har orsakat ensamhet, lidande, och döden gav också upphov till denna eklektiska besättning och deras potentiellt livräddande lösning som för bara några år sedan kunde ha verkat absurd.

"Det är bara en av de sakerna där du säger, "Vi vill åka på detta äventyr, "" säger Walter. "Vi har förbundit oss till det, och sedan fungerade det mycket bättre än vi hade kunnat drömma om."