Mekanismer för bestämning av nyttolastkapacitet och distribution av mRNA-LNPs genom PEG-innehållet. a, b De antagna sammansättningsprocesserna och egenskaperna för LNP-formulering med en hög koncentration av PEG mol% (a); eller en låg koncentration av PEG mol% (b) och sammansättningsdrift under dialys från pH 4,0 (vänster) till pH 7,4 (höger). De märkta populationsfraktionerna är verkliga data från formuleringen med PEG mol% = 1,5% (a) eller 0,5% (b). a Varje nummeretikett representerar ett populationsbeteende under dialys:1, splittring av tomma LNP; 2, stabilisering av tomma LNP; 3, uppdelning av lipofila komplex med en initialt hög mRNA-nyttolast; 4, kvarvarande en samma mRNA-nyttolast för lipofila komplex med en initialt låg eller mellanliggande nyttolast; 5, sammanslagning av tomma LNP:er med mRNA-komplex; 6, sammanslagning av icke-lipofila komplex. Korsmärket representerar upptäckten att mRNA-nyttolasten för lipofila komplex inte ökar under dialys på grund av bristen på sammansmältning under detta tillstånd. b Märkningarna är:1, smälter samman mellan lipofila komplex; 2, sammanslagning av tomma LNP:er med mRNA-komplex; 3, sammanslagning av icke-lipofila komplex; 4, uppdelning av tomma LNP. Kredit:Nature Communications (2022). DOI:10.1038/s41467-022-33157-4
En viktig komponent i vaccinerna som skyddar människor mot SARS-CoV-2-virus och dess varianter är lipidnanopartiklar, eller LNP. Dessa cirkulära partiklar bär terapeutiska mRNA-nyttolaster, bitarna av genetiskt material som utlöser vårt immunsystem att försvara sig mot COVID-19.
Även med deras framgång är vissa egenskaper hos partiklarna, såsom nyttolastfördelning, okända. Forskare och Food and Drug Administration vill ha mer insikt om dessa egenskaper för att förbättra statistikrapporteringen inom läkemedelstillverkning.
En ny plattform för molekylär detektion utvecklad av två professorer vid Whiting School of Engineering svarar på FDA:s uppmaning. Hai-Quan Mao och Tza-Huei (Jeff) Wang vill ta upp hur många mRNA-molekyler en LNP kan bära och om mRNA:t är enhetligt packat inuti partikeln för att hjälpa forskare att designa mer effektiva och effektiva behandlingar och vacciner.
"Vår plattform bearbetar molekyler på enstaka nanopartikelnivå, men till skillnad från de nuvarande avbildningsmetoderna för mRNA LNPs, är vårt tillvägagångssätt baserat på fluorescerande spektroskopi och ger oss möjligheten att se igenom partiklarna", säger Wang, professor vid avdelningarna för mekaniska ämnen. Engineering and Biomedical Engineering vid Whiting School, och en kärnforskare vid Institutet för NanoBioTechnology.
Möjligheten att titta inuti nanopartiklarna gör det möjligt för forskarna att skilja mellan och mäta tomma LNP som inte innehåller mRNA, LNP med mRNA och fritt flytande mRNA i ett prov.
Deras plattform, kallad cylindrical illumination confocal spectroscopy, eller CISC, fungerar genom att tagga mRNA- och LNP-komponenter med fluorescerande signaler i upp till tre färger och passera provet genom ett detektionsplan. Detektionsplanet läser de fluorescerande signalerna och mäter deras intensitet innan styrkan på intensiteterna jämförs med den hos en enskild mRNA-molekyl.
Dataanalysen med en algoritm som kallas dekonvolution berättar för teamet både hur många mRNA-kopior som finns inuti LNP – om några – och deras fördelning i provet. Teamets plattform övervinner kontrastbegränsningar och ökar provanalysgenomströmningen, som ses i kryotransmissionselektronmikroskopi, den nuvarande guldstandarden för avbildning av mRNA-LNP:er.
Tester utförda med denna avkänningsplattform visade att från en benchmarklösning av mRNA LNP som används i akademiska forskningsstudier är över 50 % av LNP:erna inte laddade med mRNA-molekyler, och av de mRNA-fyllda LNP:erna innehöll de flesta av dem två till tre mRNA molekyler per partikel.
"Att kunna kvantitativt lösa nyttolastegenskaper hos mRNA-LNP på singelpartikelnivå har aldrig gjorts tidigare. Vi är fascinerade av den betydande närvaron av tomma LNP:er, och genom att ändra formuleringsförhållandena kan en enda nanopartikel ladda så lite som en till som många som tio mRNA-molekyler", säger Mao, professor vid avdelningarna för materialvetenskap och teknik och biomedicinsk teknik vid Whiting School och chef för Institutet för NanoBioTechnology.
Teamets resultat publiceras i Nature Communications .
"Det finns många grupper som gör LNP-forskning," sa Wang. "Men när de upptäcker en formel som kan fungera bra, har det varit svårt att associera dessa upptäckter tillbaka till nanopartiklarnas sammansättning och nyttolastfördelning. Med den här plattformen kan vi ge en mer heltäckande förståelse för vad som händer vid den enskilda partikeln. nivå."
Mer forskning behövs för att ta reda på hur många mRNA-molekyler per LNP-kapsel som är optimal för den mest effektiva behandlingen. De tomma LNP:er som avslöjas av den nya plattformen visar dock att det finns ett behov av att förbättra metoderna för att packa mRNA:erna inuti LNP:erna.
Mao och Wang säger att deras plattform visar att den har potential att inte bara användas i alla stadier av LNP-relaterad forskning och utveckling, utan också i utvecklingen av andra läkemedelsleveranssystem och kvalitetskontrollåtgärder i tillverkningsstadiet. Teamet har lämnat in en patentansökan som täcker tekniken och arbetar med medarbetare för att använda plattformen för att analysera andra typer av terapeutiska laster i olika nanopartikelsystem för behandling av olika sjukdomar.
"FDA har nyligen tagit itu med behovet av bättre kvalitetsmått inom nanopartikeldesign inom läkemedelsindustrin", säger Michael J. Mitchell, en ledande forskare inom området för LNP-forskning och Skirkanich biträdande professor i innovation vid institutionen för bioteknik vid universitetet av Pennsylvania.
"Detta kommer att bli allt viktigare när mRNA LNP-teknik expanderar bortom vacciner till nya terapier som administreras i blodomloppet, som har mycket stränga krav. Den nya detektionsplattformen som utvecklats av Drs Mao och Wangs team är ett potentiellt viktigt steg framåt för att ta itu med behov i forsknings- och regleringsfasen, och kan potentiellt hjälpa till med utvecklingen av mRNA LNP-teknologi bortom vaccin." + Utforska vidare
