Enligt University of Wisconsins BioWeb-webbplats är en PCR-primer en kort syntetisk oligonukleotid (vanligen mellan 18 och 25 baser långa) som används för att amplifiera specifika DNA-regioner i en molekylärbiologiteknik som är känd som polymeraskedjereaktion (PCR) . Både en framåtriktad och bakre primer behövs, utformad för att vara omvänd komplement till DNA-strängen, att flankera och binda till den önskade DNA-regionen. När forskare vill utföra forskning på en specifik gen eller DNA-region, behöver de först utföra PCR för att förvärva tillräckligt med målområdet för att arbeta med. Utformning av primersekvenser för intresseområdet kan vara nödvändigt om de inte redan är tillgängliga genom tidigare publicerad forskning eller kommersiellt sätt.

Hämta nukleotidsekvensen av genen eller DNA-regionen av intresse och bestäm hur länge ett fragment du vill förstärka. Fram- och baksidan är utformad för att binda i början och slutet av det önskade fragmentet. Vanligtvis använder konventionella PCR-metoder primers som flankar en region mellan 100 och 1000 baspar lång, medan realtids-PCR-metoder använder fragment om 50 till 200 baspar långa.

Bestäm var i sekvensen du vill ha primrarna att ljuga. Till exempel kanske du vill ha platsen nära 5'- eller 3'-änden av sekvensen eller i mitten. Om så önskas, ange primerarnas placering för att spänna över en intron.

Följ de rekommenderade riktlinjerna för primerdesign. Framgångsrik förstärkning av DNA-produkt beror på primers kvalitet och vissa variabler är kritiska.

Utforma primers med 18 till 24 baser. Vincent R. Prezioso, Ph.D., från Brinkmann Instruments Inc., föreslår att denna längd är tillräckligt lång för att vara extremt specifik för den önskade DNA-regionen, men tillräckligt kort för att binda (glödgning) lätt. Primer smälttemperaturen (Tm) bör vara mellan 55 och 80 grader Celsius, tillräckligt låg för att tillåta fullständig smältning vid eller över 90 grader Celsius, men tillräckligt hög för att möjliggöra glödgning. GC-innehållet (procent av Gs och Cs i sekvensen) bör vara mellan 40 och 60 procent. Primersekvensens 3'-ände bör sluta i en C eller G (kallad en GC-klämma) för att främja bindning, eftersom G- och C-nukleotiderna har starkare bindningar, undviker emellertid att ha tre eller flera Gs eller Cs under de senaste fem baser av sekvensen.

Undvik att ha körningar med fyra eller flera av en bas (som ACCCC ...) eller fyra eller flera di-nukleotidrepetitioner (som ATATATAT ...) eftersom de kan orsaka felprovning. Designprimrar med ingen intra-primer-homologi (mer än tre baser som kompletterar sig inom den ena primern själv) eller inter-primer-homologi (där fram- och bakre primern har komplementära sekvenser). Detta kan orsaka självdimerer eller primerdimerer, där primrarna binder sig i stället för att binda till den önskade DNA-sekvensen.

Använd online resurser och webbplatser som hjälper till med primerdesign eller hjälp att kontrollera primer-sekvenser för själv- komplementaritet eller potential att göra sekundära strukturer som hårnålar. Några primerdesign webbplatser inkluderar Massachusetts Institute of Technology Primer3, National Center for Biotechnology Information's Primer-Blast och Integrated DNA Technologies 'OligoAnalyzer.