Antalet proteiner i människokroppen, gemensamt känt som proteomet, är enorm. Någonstans mellan 80, 000 och 400, 000 proteiner cirkulerar i våra celler, vävnader och organ, utföra ett brett spektrum av uppgifter som är nödvändiga för livet. När proteiner går snett, de är ansvariga för en myriad av allvarliga sjukdomar.

Nu, forskare vid Biodesign Center for Applied Structural Discovery och ASU:s School of Molecular Sciences, tillsammans med sina kollegor, undersöka en kritiskt viktig klass av proteiner, som pryder de yttre membranen av celler. Sådana membranproteiner fungerar ofta som receptorer för bindande molekyler, initierar signaler som kan förändra cellbeteende på en mängd olika sätt.

En ny metod för att skaffa strukturella data för membranproteiner i häpnadsväckande detalj beskrivs i den nya studien. Kryogen elektronmikroskopi (eller kryo-EM) metoder, en banbrytande uppsättning verktyg, är använd. Ytterligare, Användning av så kallad LCP-kristallisation och Microcrystal elektrondiffraktion (MicroED) hjälper till att avslöja strukturella detaljer hos proteiner som i stort sett varit otillgängliga genom konventionella metoder som röntgenkristallografi.

Fynden beskriver den första användningen av LCP-inbäddade mikrokristaller för att avslöja högupplösta proteinstrukturdetaljer med hjälp av MicroED. Den nya forskningen pryder omslaget till det aktuella numret av tidskriften Cell Press Strukturera .

"LCP var en stor framgång i membranproteinkristallisation, enligt Wei Liu, en motsvarande författare till den nya studien. "Den nya omfattande tillämpningen av LCP-MicroED erbjuder löfte om förbättrade metoder för strukturell bestämning från utmanande proteinmål. Dessa strukturella ritningar kan användas för att underlätta ny terapeutisk läkemedelsdesign från mer exakta insikter."

En klass av membranproteiner av särskilt intresse är G-proteinkopplade receptorer (GPCR), som bildar den största och mest varierade gruppen av membranreceptorer som finns i eukaryota organismer, inklusive människor.

De fysiologiska aktiviteterna hos GPCR är så viktiga att de är ett stort mål för ett brett spektrum av terapeutiska läkemedel. Det är dock här som problem uppstår, eftersom bestämning av den detaljerade strukturen hos membranproteiner – en viktig föregångare till korrekt läkemedelsdesign – ofta utgör enorma utmaningar.

Tekniken för röntgenkristallografi har använts för att undersöka strukturerna i atomär skala och till och med dynamiskt beteende hos många proteiner. Här, kristalliserade prover av proteinet som studeras slås med en röntgenstråle, orsakar diffraktionsmönster, som visas på en skärm. Att montera tusentals diffraktionsögonblicksbilder gör att en högupplöst 3D-strukturbild kan monteras med hjälp av datorer.

Ändå många membranproteiner, inklusive GPCR, bilda inte stora, välordnade kristaller lämpliga för röntgenkristallografi. Ytterligare, sådana proteiner är ömtåliga och skadas lätt av röntgenstrålning. Att komma runt problemet har krävt användning av speciella anordningar som kallas röntgenfria elektronlasrar eller XFELS, som kan leverera en lysande skur av röntgenljus som varar bara femtosekunder, (en femtosekund är lika med en kvadrilliondels sekund eller ungefär den tid det tar en ljusstråle att passera ett viruss diameter). Tekniken med seriell femtosekund röntgenkristallografi tillåter forskare att få en refraktionsbild innan det kristalliserade provet förstörs.

Ändå, Kristallisering av många membranproteiner är fortfarande en extremt svår och oprecis konst och endast en handfull av dessa gigantiska XFEL-maskiner finns i världen.

Gå in i kryogen elektronmikroskopi och MicroED. Denna banbrytande teknik involverar snabbfrysning av proteinkristaller i en tunn faner av is, sedan utsätta dem för en elektronstråle. Som i fallet med röntgenkristallografi, metoden använder diffraktionsmönster, denna gång från elektroner snarare än röntgenstrålar, att montera slutliga detaljerade strukturer.

MicroED utmärker sig i att samla in data från kristaller som är för små och oregelbundna för att användas för konventionell röntgenkristallografi. I den nya studien, forskare använde två avancerade tekniker i tandem för att producera högupplösta diffraktionsbilder av två viktiga modellproteiner:Proteinas K och A2A-adenosinreceptorn, vars funktioner inkluderar modulering av neurotransmittorer i hjärnan, hjärtkärlvidgning och T-cellsimmunsvar.

Proteinerna var inbäddade i en speciell typ av kristall känd som en lipidisk kubisk fas eller LCP-kristall, som efterliknar den naturliga miljön som sådana proteiner naturligt förekommer i. LCP-proverna utsattes sedan för elektronmikroskopi, använder MicroED-metoden, som tillåter avbildning av extremt tunna, kristaller i sub-mikronstorlek. Ytterligare, kontinuerlig rotation av LCP-kristaller under elektronmikroskopet gör att flera diffraktionsmönster kan erhållas från en enda kristall med en extremt låg, skadefri elektrondos.

Möjligheten att undersöka proteiner som bara kan bilda mikro- eller nanokristaller öppnar dörren till den strukturella bestämningen av många livsviktiga membranproteiner som har undgått konventionella metoder för undersökning, särskilt GPCR.