Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) är en biokemisk metod för att identifiera proteiner i lösning. Som illustreras av Mathews et al i "Biochemistry" laddas proteinprover först i "brunnar" eller hål i ena änden av polyakrylamidgelblocket. Ett elektriskt fält appliceras sedan på gelén. SDS, tillsatt till de laddade proverna, negerar den naturliga laddningen av proteiner. Av detta skäl bestämmer proteinmolekylvikt ensam migrationshastigheten för proteiner när de rör sig genom gelén mot den positivt laddade polen, noterar Bitesize Bio. Flera proteiner i samma prov kommer därför att skilja sig från varandra och migrera till olika positioner.
Orientera gelläget. "Top" är platsen för brunnarna där proven ursprungligen tillsattes. "Bottom" är där proverna migrerade mot och oftast innehåller färgämnefronten som indikerar provrörets främre del. Antingen vänster eller höger ska innehålla en "markör" som används som en förutsägbar molekylviktsguide.
Märk proverna för varje lane. Över toppen kommer de prov som läggs till brunnarna att ha migrerat vertikalt i "banor". Därför kom alla staplarna synliga i en vertikal kolumn från det enda provet som laddades direkt ovanför det. Använd linjalen och penna för att lägga gränser på banorna om det är svårt att visualisera kolumner.
Märk de molekylära storlekarna på banden i markörbanan. Kommersiellt tillgängliga markörer kommer med en bild av bandmönstret att förvänta sig tillsammans med molekylvikterna hos varje band. Band är de mörka horisontella "staplarna" som faktiskt är färgade proteiner inbäddade i gelén.
Dra lätta horisontella linjer som sträcker sig från varje märkband till gelens motsatta kant. Var försiktig med att göra dessa linjer parallella med brunnarna och på färgämnefronten. Dessa linjer indikerar var proteiner med molekylvikten som indikeras av var och en av markörbanden skulle vara belägna i varje bana. Till exempel kan ett band i lane 4 som ligger strax under linjen som sträcker sig från 25 kilodaltonmarkörbandet antyka att lane 4-bandet är nästan men inte riktigt 25 kilodalton i molekylvikt.
Märk varje band i varje bana med sin beräknade molekylvikt. Använd markörerna som en guide och uppskatta värden mellan markörstorlekar.
Under gelbilden gör du en lista över "proteiner" för varje bana. Börja med att ange vad som är känt för varje prov, såsom dess ursprung eller förhållanden. Anteckna sedan den beräknade molekylvikten för varje band i banan. Banor med ett band indikerar att provet bara innehåller ett protein. Banor med flera band indikerar närvaron av flera proteiner. Band som körs med migrationsfronten är mindre än vad som föreslagits av närmaste markör och sannolikt kan inte förutsägas, förutom som "mindre än" markören indikerar.
Notera oddities i proteinerna. Ett "utsmyckat" utseende kan indikera att alltför många proteiner är närvarande eller att provets viskositet påverkar dess migrering Om band verkar gå utöver kanten av banan eller är ganska stor jämfört med andra band, så är koncentrationen av proteinet sannolikt för högt och bör spädas i framtida elektrofores. En gråaktig nyans i hela banan, mörkare än bakgrundsgelfärgen, indikerar odelbara proteinfragment.
Bestäm proteinernas identitet i varje fil. Även om detta görs med enbart molekylvikt, kommer källan till varje lane sannolikt att indikera ledtrådar också. Tänk på att under vissa förhållanden kan proteiner upprätthålla en dimer eller trimer association på en gel. Därför kan ett protein visas på en gel som tre distinkta band. Även om proteiner inte kan identifieras kan bandets relativa mörkhet innebära koncentrationerna av proteinerna i lösning. Eventuella nyfikna och okända proteiner kan isoleras direkt från den ursprungliga gelén och skickas för identifiering.
