Doktorand Jared Carlson-Stevermer observerar CRISPR/Cas9-genredigering i realtid vid mikroskopet. Kredit:Stephanie Precourt.
De senaste fem åren, CRISPR-Cas9-teknologin har revolutionerat området genredigering på grund av dess lätthet och låga kostnad. Men även om den här tekniken på ett tillförlitligt sätt hittar och skär den riktade sträckan av DNA-sekvens, att fixa det klippet som önskat har varit något av en hit-or-miss-process. Så höga felfrekvenser som 50 procent är ett särskilt problem när målet är att rätta till stavfel i DNA:t som orsakar genetisk sjukdom.
Nu, ett team av forskare ledda av Krishanu Saha, en professor i biomedicinsk teknik vid University of Wisconsin–Madison, har gjort korrigeringen mindre felbenägen och publicerade sitt tillvägagångssätt idag (23 nov. 2017) i tidskriften Naturkommunikation .
Jämfört med standard CRISPR-teknik, den nya metoden förbättrar sannolikheten för att skriva om DNA-sekvensen exakt som önskat med en faktor 10. Forskarna uppnådde denna mycket större precision genom att dra fördel av ett molekylärt lim, kallas en RNA-aptamer, för att montera och leverera ett komplett CRISPR-reparationssats till platsen för DNA-snittet.
"Kitet tillhandahåller inte bara den molekylära saxen, men också rätt mall för cellmaskineriet att fixera DNA-klippet med, " säger Saha. "Eftersom RNA-aptameren är stark och mycket stabil, allt vi behöver är att komma till rätt plats i cellen i ett svep."
I standard CRISPR-teknik, det bakteriehärledda Cas9-proteinet (saxen) och en guide-RNA-molekyl (för att lokalisera den riktade DNA-sekvensen) levereras till cellen. När saxen skär upp DNA-molekylen, cellen lagar gapet med närliggande DNA-mallar, men mer trogen omskrivning blir resultatet av att fästa de önskade mallarna till Cas9/RNA-paketet med det molekylära limmet.
Krishanu Saha (baksida) och Jared Carlson-Stevermer har modifierat CRISPR/Cas9-genredigeringsteknologin för att göra den mer exakt och tillförlitlig. Kredit:Stephanie Precourt
Den nya metoden har flera andra fördelar jämfört med dagens teknik. Först, hyllpaketet innehåller endast icke-virala reagenser, vilket förenklar tillverkningsprocessen och minskar säkerhetsproblem för kliniska tillämpningar av genetisk kirurgi i framtiden. Andra, Att fästa en RNA-aptamer till kitet är mycket lättare än att modifiera Cas9-proteinet och ger större flexibilitet.
"Vi kan lägga till andra biomolekyler till detta kit, ungefär som du skulle klicka in ett extra LEGO-block i en redan befintlig struktur, " säger Jared Carlson-Stevermer, en doktorand i Sahas labb och tidningens första författare.
Ett exempel på ett sådant LEGO-block är fluorescerande taggar som gör det möjligt för forskare att enkelt identifiera alla exakt redigerade DNA-sekvenser i en population av celler.
"Genom att fiska fram dessa taggar, vi kan uppnå en noggrannhetsgrad på 98 procent, säger Saha.
Andra typer av LEGO-klossar kan hjälpa till att aktivera reparationssatsen i rätt sorts vävnad:ögat för att behandla retinala sjukdomar, eller muskelcellerna hos muskeldystrofipatienter. I den aktuella studien, forskarna korrigerade en specifik mutation i stamcellslinjer som härrörde från en patient med Pompes sjukdom med kraftigt förbättrad trohet. Pompes sjukdom är en sällsynt ärftlig sjukdom som orsakas av ansamling av komplexa sockermolekyler i organ och muskelvävnad.
"Det finns ingen brist på kandidater för den här typen av genetisk kirurgi, eftersom tiotusentals sjukdomar beror på små sekvensfel som skulle kunna fixas med denna teknik, Saha säger. "Vårt nästa mål är att testa metoden i djurmodeller och arbeta med att skriva längre DNA-sträckor."
