Celler surrar av miljontals olika biomolekyler som diffunderar kaotiskt genom sina understrukturer, men ändå lyckas de säkerställa utsökt funktionell och rumslig specificitet.
Distinkta biomolekyler interagerar specifikt i cellulära processer och leder till riktade cellulära svar. Detta uppnås ofta genom att styra biomolekyler till subcellulära avdelningar. Fack som mitokondrier är rumsligt åtskilda av membran. Andra, som nukleoler, har inga membrangränser alls.
Hur dessa membranlösa fack bildas är fortfarande ett av biologins största mysterier. På senare år har ett fenomen som kallas vätske-vätskefasseparation (LLPS) föreslagits som drivkraften för montering av fack.
Gruppen av Andrea Musacchio, direktör vid Max Planck Institute of Molecular Physiology, har nu utvecklat en valideringsstrategi för att utvärdera rollen av LLPS i kompartmentbildning och för att bedöma vanliga metoder för att detektera LLPS-egenskaper. Studien är publicerad i tidskriften Molecular Cell .
Att tillämpa strategin på processen för centromersammansättning under celldelning, som föreslogs drivas av en LLPS-ställning (kromosompassagerarkomplexet, eller CPC), misslyckades med att identifiera LLPS som en avgörande drivkraft, vilket bekräftar den låga prediktiva kraften hos dessa analyser . Denna nya strategi har potential att bli ett viktigt verktyg för att validera rollen för andra potentiella LLPS-drivrutiner som hittills identifierats.
Proteiner, som fyller de flesta funktionerna i vår kropp genom att interagera med andra proteiner, står inför ett dilemma – de rör sig runt cellen med 40 miljoner potentiella interaktionspartners.
Att hitta rätt partner kan därför verka som att leta efter en nål i en höstack. Men om sannolikheten att ett protein träffar rätt partner vid rätt tidpunkt av en slump kan verka låg - har cellen hittat en strategi för att sammanföra proteiner som liknar att träffa en potentiell partner på jobbet, på ett café eller i klubben:Spatial ledtrådar leder proteiner till definierade cellkompartment, såsom plasmamembranet eller mitokondrien.
Processen med celldelning, till exempel, initieras av signaleringsprocesser vid cellmembranet, vilket aktiverar enzymer vars signaler slutligen når cellkärnan för att utlösa riktad gentranskription.
Under den efterföljande celldelningen leder en mängd specifika proteininteraktioner till bildandet av ett flerskiktigt proteinkomplex vid kromosomernas centromerer, vilket säkerställer felfri distribution av kromosomerna i en modercell till dess två döttrar.
Naturen har utvecklat en viss kemi för interagerande proteiner:Proteiner avsedda för varandra är utrustade med evolutionärt konserverade och exponerade gränssnitt med detaljerade kemiska identiteter i sin 3D-struktur som är komplementära till varandra. Dessa motiv finns över arter och möjliggör mycket specifika proteininteraktioner.
Vid förra sekelskiftet observerades först de första cellulära avdelningarna som inte var avgränsade av fysiska gränser. Vi vet nu att nukleoler, P-kroppar eller stressgranuler koncentrerar makromolekyler, främst proteiner och RNA, och har viktiga funktioner i cellen.
Upptäckten av dessa membranlösa fack har öppnat upp ett nytt forskningsfält fullt av obesvarade frågor, varav den mest utmanande är hur dessa fack bildas och hur de bibehåller sin struktur.
Under de senaste åren har tanken att dessa fack bildas genom en process som kallas vätske-vätskeavblandning eller vätske-vätskefasseparation, jämförbar med spontan bildning av oljedroppar i vatten, tagit stor fart.
Enligt denna uppfattning är membranlösa fack "kondensat" vars bildning är baserad på övergående, svaga och ospecifika interaktioner av "drivar"-proteiner, vilket i slutändan orsakar deras ackumulering där vid koncentrationer som är högre än i det omgivande mediet.
Analyser som undersöker fasseparationsegenskaper hos proteiner utanför cellen har hittills identifierat dussintals av dessa drivkrafter, inklusive det kromosomala passagerarkomplexet (CPC), som har påståtts bilda kondensat vid centromeren för att modulera dess organisation och funktion under mitos.
"Fasseparation har för många forskare blivit standardförklaringen till bildandet av membranlösa fack. Det finns dock få bevis för att LLPS-analyser utförda in vitro verkligen kan förutsäga en fysiologisk process i cellens miljö", säger Musacchio.
Tillsammans med sitt team har han utvecklat en strategi för att utvärdera en allmänt använd LLPS-analys och dess prediktiva kraft, och tillämpat den på CPC.
"Enligt vår mening är en stor svaghet med analyserna att det inte modellerar lösningsmedlet med tillräcklig noggrannhet. Lösningsmedlet definierar ett proteins löslighet och därmed dess förmåga att interagera med andra proteiner."
För att efterlikna cellens naturliga miljö så nära som möjligt lade forskaren utspädda bakterie- eller däggdjurscellysat till standard LLPS-buffertar. Även vid mycket utspädda koncentrationer förhindrade lysat fullständigt bildandet av kondensat. För att bedöma hur allmänt detta var, upprepade forskarna samma experiment med flera ytterligare proteiner, som alla visade LLPS-egenskaper i standardanalysen. Och faktiskt, i alla fall löste tillsats av cellysat upp "kondensatet."
"Dessa resultat bekräftar vårt antagande att den cellulära miljön effektivt buffrar de ospecifika svaga interaktioner som tros orsaka LLPS in vitro", säger Musacchio.
Interaktioner och funktioner hos proteiner i cellen är starkt reglerade av så kallade posttranslationella modifieringar. Riktad tillsats eller borttagning av fosfatgrupper på kritiska platser kan till exempel störa interaktionen mellan två proteiner med omedelbar effekt. Dessa naturliga modifieringar kan efterliknas i laboratoriet genom mutationer och är den bästa metoden när det gäller att undersöka många cellulära processer.
Genom att introducera mutationer vid fyra rester som är involverade i igenkännandet av fosforylerade signaler, genererade forskaren en mutant av CPC som inte kan rekryteras till centromerer och inte ackumuleras där. Ändå visade denna mutant fortfarande full LLPS-potential i in vitro-analysen, vilket visar att analysen inte kan förutsäga CPC-lokalisering och funktion.
"Våra resultat visar att LLPS av en enskild komponent in vitro inte kan förutsäga löslighet och lokalisering i den komplexa och trånga miljön i cellen. Listan över förmodade LLPS-ställningar som identifierats genom de etablerade analyserna kommer att behöva omfattande omprövning, och valideringsstrategin vi som presenterar här kan vägleda denna ansträngning", säger Musacchio.
"I framtiden planerar vi att upprepa våra experiment med många förmodade LLPS-ställningar, särskilt de som har blivit flaggskepp i tillväxten av LLPS-området. Våra experiment visar att cytosolen är ett potent lösningsmedel vars roll inte kan försummas. Därför kommer att vara viktigt att generera lämpliga cytomimetiska medier som standarder för att bedöma biokemiska reaktioner in vitro. Vi kommer att försöka bidra till detta forskningsområde."
Mer information: Marius Hedtfeld et al, En valideringsstrategi för att bedöma rollen av fasseparation som en bestämningsfaktor för makromolekylär lokalisering, Molecular Cell (2024). DOI:10.1016/j.molcel.2024.03.022
Journalinformation: Molekylär cell
Tillhandahålls av Max Planck Society
