LMU-forskare har utvecklat en metod för att bestämma hur tillförlitligt målproteiner kan märkas med superupplösningsfluorescensmikroskopi.

Moderna mikroskopitekniker gör det möjligt att undersöka cellers inre funktion i häpnadsväckande detalj. "Vi kan nu observera arrangemanget och interaktionen mellan enskilda proteiner under mikroskopet", säger professor Ralf Jungmann, ordförande för Molecular Physics of Life vid LMU och Max Planck Fellow vid MPI of Biochemistry.

Biofysikerns team utvecklade nyligen den revolutionerande RESI-metoden (Resolution Enhancement by Sequential Imaging). Denna teknik kan användas för att förbättra upplösningen av fluorescensmikroskopi ner till Ångströmskalan – långt under den klassiska diffraktionsgränsen för ljus. DNA-konjugerade markörmolekyler, som forskarna fäster just vid de molekyler de vill förstå bättre, är avgörande för detta.

Jungmanns team har nu presenterat en teknik i tidskriften Nature Methods som kan användas för att kvantifiera hur väl biomarkörmolekyler binder till målproteinerna. "Detta är helt avgörande om du vill göra kvantitativt tillförlitliga påståenden", förklarar fysikern.

Om du känner till märkningseffektiviteten kan du utföra rumsligt upplöst proteomik på detta sätt. Detta gör att du kan ta reda på inte bara vad enskilda proteiner gör i en cell, utan också i vilken utsträckning de finns och hur deras kvantitet och beteende förändras under vissa omständigheter. "Men detta är bara möjligt om vi kan bedöma hur väl märkningen har fungerat." Detta beror på att endast märkta proteiner avger ljusblixtar under mikroskopet och blir därmed synliga.

Metoden som utvecklats av Jungmanns team gör denna bedömning möjlig genom att lägga till en referensbiomarkör till målproteinerna. Denna markör "glöder" i en annan färg under mikroskopi, så att framgångsrikt markerade proteiner visas i två färger.

Jungmanns team visade detta med hjälp av membranproteinet CD86, bland annat:Referensen producerar en rosa fluorescens, den faktiska markören en blåaktig sådan. Detta skapar ett mönster av otaliga rosa och blå ljuspunkter. Där markeringen inte fungerade lyser endast referensen individuellt. Markeringseffektiviteten beräknas från förhållandet mellan dubbel- och enkelbelysta molekyler.

Metoden erbjuder flera fördelar jämfört med tidigare metoder för att bestämma bindningseffektivitet, "Det fungerar inte bara in vitro, utan också in vivo, d.v.s. i samband med intakta celler", förklarar Jungmann. "Tekniken kan också tillämpas på en mängd olika målmolekyler, biomarkörer och prover och är kompatibel med en hel rad superupplösningsmetoder."

Ett tillförlitligt och allmänt tillämpligt sätt att bedöma marköreffektivitet är avgörande för att säkerställa korrekt datautvärdering och möjliggöra tillförlitliga jämförelser mellan olika bindemedel, märkningsförhållanden och forskningslaboratorier.

Författarna till studien är säkra på att den nya kvantifieringsmetoden har banat väg för att avsevärt utöka potentialen för deras superupplösningsmikroskopmetod, "Nu kan vi också överväga specifika biomedicinska tillämpningar där den kvantitativa detektionen av proteiner och processer är av stor betydelse. betydelse", säger Jungmann.

Detta inkluderar till exempel cancerforskning, där information om interaktioner mellan proteiner på cellytan och läkemedel med molekylär upplösning är avgörande för utvecklingen av nya typer av läkemedel.

Mer information: Joschka Hellmeier et al, Kvantifiering av absolut märkningseffektivitet på enkelproteinnivå, Naturmetoder (2024). DOI:10.1038/s41592-024-02242-5

Journalinformation: Naturmetoder

Tillhandahålls av Ludwig Maximilian University of München