I molekylärbiologi kan bra buffertval och förberedelse för olika DNA-isoleringssteg vara skillnaden mellan att gå vidare till proteinuttryck eller öppna ett annat maxi-prep-kit för att börja om. Trots deras avgörande betydelse är buffertrecept ofta bara det - recept skrivna utan förklaring eller skäl för de olika komponenterna. En sådan buffert är glukos-tris-EDTA eller GTE-buffert.
Vad används GTE för?

GTE används för att resuspendera bakteriecellpellets innan lysering (brytning) av cellerna och skörd av plasmid-DNA inuti. Lysozym, som mjukar upp cellmembranen, tillsätts ofta tillsammans med GTE-bufferten. Att uppnå en homogen suspension av hela celler under detta steg så att den därefter tillsatta lyslösningen kan komma till alla celler är nyckeln till att få bra DNA-utbyten. GTE är utformat för att göra detta samtidigt som det ger en stabil miljö för DNA.
Glukos för osmolaritet nära det inuti cellerna. Detta förhindrar för tidig celllys, vilket kan orsaka lägre DNA-utbyten på grund av aggregering och nedbrytning. De andra komponenterna i bufferten bidrar också till lösningens osmolaritet, men glukos, som är en icke-elektrolyt, är ett bra val eftersom det inte påverkar lösningens buffertegenskaper.
Tris för pH-stabilitet

Tris är det korta namnet på tris (hydroximetyl) aminometan, som är en mycket vanlig pH-buffert. I fallet med GTE-buffert tillsätts syrasaltet (Tris-HCl) till bufferten i en koncentration av 25 mM. Detta upprätthåller lösningens pH vid en nästan fysiologisk 8,0, ett idealiskt pH för att förhindra sur hydrolys (nedbrytning) av plasmid-DNA och oönskade sidoreaktioner av de andra cellkomponenterna.
EDTA Förhindrar DNA-nedbrytning

EDTA, eller etylendiaminetetraättiksyra, fångar eller "kelaterar" metalljoner ur lösningen, vilket hindrar dem från att delta i oönskade sidoreaktioner. I GTE-buffert tillsätts EDTA vid 10 mM. Det främsta syftet är att bufferten ska runda upp fritt zink, magnesium och kalcium, och därigenom förhindra nedbrytning av DNA genom vissa vägar som kräver dessa metaller.
Några viktiga tips.

Håll din GTE-buffert kall och gör den i små mängder för att förhindra tillväxt av oavsiktliga bakterier i den. Socker och det kontrollerade pH-värdet ger ett bra tillväxtmedium. Använd alltid renat vatten. Kranvatten kan ha ett överskott av metalljoner från rören, vilket kan överväldiga EDTA: s förmåga att fånga. Om du misstänker att det finns störande RNA i ditt prov, lägg till RNase A med 100 mikrogram per milliliter till din GTE-buffert för att eliminera problemet.