1. Isolera den humana insulingenen
* mRNA -extraktion: Mänskligt insulin -mRNA extraheras från celler som producerar insulin (betaceller i bukspottkörteln).
* omvänd transkription: MRNA omvandlas till komplementärt DNA (cDNA) med användning av omvänt transkriptas. Detta cDNA är en stabil kopia av insulingenen.
2. Modifiera genen (valfritt)
* Optimering för bakterieuttryck: Insulingenen kan behöva små modifieringar för att säkerställa att den uttrycks optimalt av bakterier. Detta kan innebära:
* Byt kodoner: Den genetiska koden kan ändras något för att matcha de föredragna kodonerna som används av bakterier.
* Lägg till restriktionsenzymplatser: Detta möjliggör exakt införande i plasmiden.
3. Förbereda plasmiden
* att välja plasmid: En lämplig plasmidvektor väljs. Dessa är små, cirkulära DNA -molekyler som kan replikera oberoende inuti bakterier. De har vanligtvis:
* Replikations ursprung: Denna sekvens gör det möjligt för plasmiden att replikera i bakteriecellen.
* antibiotikaresistensgen: Denna gen möjliggör val av bakterier som bär plasmiden.
* Multiple Cloning Site (MCS): Denna region innehåller en mängd olika restriktionsenzymigenkänningsställen, vilket möjliggör enkel insättning av insulingenen.
4. Klippa plasmiden och infoga genen
* Begränsningsenzymer: Plasmiden och insulingenen skärs med användning av restriktionsenzymer, som känner igen specifika DNA -sekvenser. Detta skapar matchande "klibbiga ändar" på båda DNA -molekylerna.
* ligering: Den snittade plasmiden och den modifierade insulingenen blandas tillsammans med DNA -ligas. Detta enzym förenar de klibbiga ändarna och sätter in insulingenen i plasmiden.
5. Transformerande bakterier
* kompetenta celler: Bakterier görs "kompetenta" för att ta upp DNA. Detta kan innebära att man behandlar dem med kalciumklorid eller andra metoder.
* Transformation: Plasmiden som innehåller insulingenen införs i de kompetenta bakteriecellerna.
* val: Bakterier som framgångsrikt har tagit upp plasmiden väljs genom att plätera dem på ett tillväxtmedium som innehåller det antibiotikum som plasmiden ger resistens mot. Endast de bakterier som har plasmiden kan överleva.
6. Uttryck av insulin
* Produktion: De transformerade bakterierna bär nu den humana insulingenen och uttrycker den och producerar humant insulinprotein.
* rening: Insulinproteinet extraheras och renas från bakteriecellerna.
Sammanfattningsvis:
Denna process möjliggör storskalig produktion av humant insulin, en viktig behandling för diabetes. Genom att kombinera kraften i genteknik, bakteriekläder och stränga reningsmetoder kan forskare producera säkert och effektivt insulin för miljoner människor över hela världen.
