Gelelektrofores är fortfarande en hörnstensteknik inom molekylärbiologin, som gör det möjligt för forskare att separera DNA-fragment efter storlek och avgift för tillämpningar som DNA-fingeravtryck, restriktionskartläggning och sekvensering.
Eftersom DNA i sig är färglöst lägger forskare till spårningsfärgämnen - blå eller orange pigment - till provet. Dessa färgämnen migrerar tillsammans med DNA:t och ger en visuell referens som låter användaren mäta framsteg och säkerställa korrekt bandidentifiering.
I den här metoden, en platta av agarosgel —en polysackarid som härrör från tång — framställs genom att blanda agarospulver med en buffert som innehåller vatten och salt. Blandningen upphettas tills agarosen löser sig och kyls sedan för att bilda en porös matris. Gelén placeras i en elektroforeskammare och täcks med ledande buffert.
DNA-prover, kombinerade med ett laddningsfärgämne, laddas i brunnar vid den negativa (−) änden av gelén. En positiv (+) elektrod är placerad på motsatt sida. Den negativt laddade fosfatryggraden i DNA driver fragmenten mot den positiva elektroden när det elektriska fältet appliceras.
Mindre fragment möter mindre motstånd och reser snabbare, vilket ger distinkta band som motsvarar fragmentstorleken.
Att ladda färgämnen fyller två primära funktioner:de ökar provets densitet så att det sjunker ner i brunnen, och de ger en visuell signal som spårar migrationen av DNA. Vanliga färgämnen inkluderar bromfenolblått (optimalt för fragment runt 400 bp) och xylencyanol (bättre lämpad för fragment på 2–8 kbp). Färgämnet är valt så att det inte reagerar med eller förändrar DNA:t. Forskare använder vanligtvis 5 µL laddningsfärg per 1 µL DNA-prov, enligt riktlinjer från NEB och Thermo Fisher.
Glycerol tillsätts till provet för att öka dess densitet. Utan glycerol skulle vätskeprovet spridas över gelytan istället för att lägga sig prydligt i brunnen, vilket äventyrar bildandet av klara, distinkta band.
För proteinseparation ersätter natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) agaros. Bromfenolblått inkorporeras rutinmässigt i provbufferten; den färdas i samma takt som framkanten av proteinbanden, och erbjuder en visuell realtidsindikator på framsteg.
Efter elektrofores, DNA-bindande färgämnen som etidiumbromid tillämpas. Etidiumbromid interkalerar mellan DNA-baser och fluorescerar starkt under ultraviolett ljus, vilket gör band synliga. Eftersom det är mutagent krävs strikta säkerhetsåtgärder vid hantering och kassering av färgämnet.
