Vid arbete med högprestandad vätskekromatografi (HPLC) är god kalibrering absolut nödvändig för att säkerställa pålitliga, kvalitetsresultat. Korrekt kalibrering av ett HPLC-instrument börjar med att göra en lämplig kalibreringsstandard. I de flesta fall kräver kalibrering i själva verket en serie standarder för ökad koncentration för att producera det som kallas kalibreringskurva. Detta är en plottad linje och tillhörande ekvation som beskriver förhållandet mellan koncentrationen av den kemikalie som testas för och svaret från HPLC-detektorn.
Bestäm den kemikalie som du vill testa för att använda HPLC (" analyt "). Till exempel kanske du vill testa en serie läskedrycker för fruktosinnehåll, i vilket fall fruktos skulle vara analyten.
Hämta en mängd analytkemikalier av lämplig renhet. Normalt bör renheten vara över 99% och analyten bör köpas från ett välrenommerat kemiskt försörjningsföretag. När det gäller fruktos, till exempel, skulle du köpa ren fruktos från en kemisk leverantör och inte från en livsmedelsbutik.
Bestäm maximala och minsta förväntade koncentrationer av analyten i de prover du tänker testa på HPLC. När det gäller läsk, undersöker du etiketterna för dryckerna och bestämmer lägsta och högsta fruktosinnehållet bland de drycker du ska testa. Tänk på att det ursprungliga provet (läskedrycket) kan spädas eller på annat sätt manipuleras under beredning för analys (beroende på vilken HPLC-metod som används) och så kan analyskoncentrationen i de prover som faktiskt injiceras på HPLC modifieras. Det är analyskoncentrationen i proverna som körs på HPLC som måste beaktas.
Bestäm lösningsmedlet i vilket du kommer att lösa upp din analyt för att kompensera kalibreringsstandarderna. Detta lösningsmedel måste kunna lösa analysen ordentligt över ett relativt stort koncentrationsområde (minst lika högt som i de prov du avser att testa). Liksom detta lösningsmedel borde idealt sett vara ganska lik den "mobila fasen:" lösningsmedlet använde för att bära prov genom HPLC-instrumentet.
Beräkna mängden analyt som krävs för att göra en "stamstandard" -lösning av analyt. Detta hittas genom multiplicering av den erforderliga koncentrationen av beståndsstandarden med önskad volym. Koncentrationen av analyten i denna lösning bör vara minst 10% högre än den högsta förväntade provkoncentrationen. Om den högsta förväntade fruktoskoncentrationen i ett prov med läsk är 8 gram /100 milliliter, kan beståndsstandarden göras till en koncentration av 10 gram fruktos /100 milliliter. En rimlig volym är 500 milliliter, sålunda 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fruktos skulle behövas.
Väg ut den önskade mängden analyt till en lämplig precisionsnivå. Ofta är ett viktvärde i gram som är exakt till en eller två decimaler lämpligt, men mer precision kan vara nödvändigt för vissa metoder.
Överför den vägda analyten till en volymkolv med nödvändig volym och tillsätt det önskade lösningsmedlet till fyllnadsmärket på kolven. Användning av en volymkolv (i stället för en examenbägare, till exempel) ökar precisionen av beståndsstandardkoncentrationsvärdet. Se till att all analyt överförs till kolven. använd en del av lösningsmedlet för att tvätta det i, om det behövs.
Stoppa volympolven och försiktigt skaka eller invertera tills analyten är helt upplöst.
Gör en serie med olika utspädningar av beståndet standard genom att överföra kända volymer av beståndsstandarden till volymetriska kolvar, med hjälp av pipetter för korrekt överföring och sedan tillsätta lösningsmedel. Den lägsta standardkoncentrationen bör ligga under det lägsta antagna provet som ska analyseras. I läskedrycksexemplet, om den lägsta förväntade fruktoskoncentrationen i ett prov är 2 gram /100 ml, kan en 1 gram /100 ml standard göras. Detta skulle göras genom en tiofaldig utspädning av beståndsstandarden. Standardserien bör innehålla totalt 5 eller 6 koncentrationer, så ytterligare utspädningar för att producera standarder på kanske 3, 5 och 8 gram fruktos /ml skulle krävas. Du har nu en serie standardlösningar för att kalibrera HPLC.
Tips
Det är möjligt att göra kalibreringsstandarder som innehåller mer än en analyt vid behov. Det är ofta bra att filtrera kalibreringsprover (och standarder) innan de injiceras på HPLC för att ta bort eventuella fina partiklar som kan ansluta instrumentet.
Varning
Vissa standarder försämras snabbt efter det att de är gjord. Se till att dina standarder byts ut ofta om så är fallet. Som vid alla kemiska förfaranden, observera lämpliga försiktighetsåtgärder vid arbete med potentiellt skadliga analyter eller lösningsmedel som de som är giftiga eller brandfarliga.
