Analys av DNA är användbart för ett antal vitala tillämpningar. Detta inkluderar diagnos och övervakning av sjukdomar, identifiering av brottslingar, och studerar funktionen av ett riktat segment av DNA. Dock, Metoder som används för analyser kräver ofta mer DNA än vad som kan finnas tillgängligt i ett typiskt prov. 'Därför, förstärkning är nödvändig, men inte alltid direkt. Den mest använda amplifierings- eller fotokopieringsmetoden är polymeraskedjereaktionen (PCR). En ny PCR-metod kan hjälpa amplifieringsprocessen, och därmed utveckla robusta analyser som tidigare inte skulle ha varit möjliga.

Deoxiribonukleinsyra (DNA) är en molekyl som finns i cellkärnan och bär "instruktionerna" för utveckling och funktion av levande organismer. Det jämförs ofta med en uppsättning ritningar eftersom det innehåller instruktionerna som behövs för att bygga celler. Dessa instruktioner är indelade i segment längs en DNA -sträng.

Replikering

DNA består av en dubbelhelix av två komplementära strängar gjorda av nukleotider, en struktur som ofta jämförs med en stege. När det är dags att replikera, de två DNA-strängarna – eller "sidorna" av stegen- lindas upp och separeras. Ett enzym som kallas DNA-polymeras läser de individuella strängarna och matchar komplementära baser - stegens "steg" - med den ursprungliga strängen. Nya trådar produceras på båda sidor av det ursprungliga DNA:t, gör två identiska DNA-dubbelhelixar bestående av en original och en ny sträng. Denna process förekommer i alla levande organismer och är grunden för biologiskt arv.

PCR

Replikering kan också bearbetas artificiellt. Kallas ibland "molekylär fotokopiering, "polymeraskedjereaktionen (PCR) är en snabb och relativt billig teknik som används för att förstärka, eller göra många kopior av, små DNA-segment. Detta är nödvändigt eftersom metoder som används för att analysera DNA eller bestämma DNA -basparets sekvens kräver mer DNA än vad som kan finnas i ett typiskt prov. Därav, Målet med PCR är att amplifiera en specifik region av en DNA-sträng.

För att utföra PCR, de två strängarna i DNA-dubbelhelixen separeras fysiskt genom att applicera hög temperatur (93-98 ° C) i en process som kallas DNA-smältning. I det andra steget, temperaturen sänks och de två DNA-strängarna, nu separerade, bli mallar för så kallade primers. Primers är korta enkelsträngade DNA-molekyler, komplement till DNA -regionen som är inriktad på amplifiering. Efter att ha sänkt temperaturen, primrarna som läggs till PCR-processen hittar och binder till dess specifika mål. Ett enzym som kallas DNA -polymeras kommer att förlänga - eller bygga - en ny DNA -sträng från primern med hjälp av den underliggande enkelsträngade DNA -molekylen som en mall.

Bygger en stege

Som nämnts ovan, primers är korta enkelsträngade DNA -molekyler. Dessa är vanligtvis runt 20 nukleotider långa. Denna sträng av nukleotider, fäster specifikt i början av mallsträngen genom basparning - hitta de kompletterande baserna. DNA-polymeras kan sedan lägga till nästa komplementära nukleotid. Polymeraset fortsätter att lägga till fler komplementära nukleotider till mall-DNA tills en ny dubbelsträng av DNA är färdig, eller att använda metaforen ovan; en ny stege byggs, med en originalsida och en ny sida.

Dubbla primrar gör det möjligt att exakt definiera området för en DNA -molekyl som ska amplifieras av PCR. Dessa två flankerande primers anger var den nya kedjan ska börja och sluta.

Ett litet paradigmskifte

En central regel som är starkt förankrad i molekylärforskarens sinne är att primers endast ska komplettera målsekvensen, och inte med varandra. Detta för att undvika att primrar använder varandra som mallar och därmed inaktiverar ytterligare möjlig inblandning i traditionell målamplifiering.

I en nyligen genomförd studie publicerad i den vetenskapliga tidskriften PLOS One , Seniorforskare Marc Anglès d´Auriac med Norwegian Institute for Water Research (NIVA) visar att det är möjligt att använda mycket kompletterande primers och ändå undvika de olyckliga konsekvenserna som nämns ovan. Den nya metoden har fått namnet COMPAS-PCR, förkortning för COMplementary Primer Asymmetric PCR.

Kortfattat, Anglès d'Auriac observerade att primers som kompletterar varandra och ett mål (trippelöverlägg) fortfarande kan definiera en förstärkningsprodukt när de ingår i ett upprepat DNA -motiv eller en struktur. Detta visas i figuren nedan. Ytterligare, det fysiska hindret av målamplifiering på grund av primerkomplementaritet lindrades genom att införa asymmetriska primerkoncentrationer. Asymmetrisk betyder i detta avseende ojämnt antal molekyler mellan de två primrarna. En primer består av ett lågt antal molekyler, den andra med ett högt antal.

"Om du använder lika koncentrationer, som du brukar göra för PCR, primrarna, närvarande i lika stora mängder, kommer att hålla fast vid varandra, "Anglès d'Auriac säger.

"Med asymmetriska koncentrationer, överskottet eller högkoncentrerad primer har ett antal molekyler som inte har fastnat med den begränsande primern, och är därför tillgänglig för målförstärkning. "

Arbetar ensam

"Detta kontraintuitiva tillvägagångssätt kommer att isolera, men också skydda, lågkoncentrationsprimern, " säger Anglès d'Auriac.

När den begränsande primern har fastnat, och därmed skyddad, det är möjligt för primern med hög koncentration att fungera ensam, det är, göra en enkelsträngskopia av DNA-målet. När tillräckliga enkelsträngade amplikoner produceras, de kan tjäna som mallmaterial för primern med låg koncentration. Den begränsande primern frigörs, och reaktionen växlar till klassisk exponentiell PCR -amplifiering.

"Detta utökar PCR-applikationsmöjligheterna för forskaren, Anglès d'Auriac förklarar."

Upprepande strukturer

I många organismer, en betydande del av det genomiska DNA:t är mycket repetitivt, med över hälften av sekvensen bestående av repetitiva element hos människor.

Det var verkligen en repetitiv DNA-struktur som fick Anglès d'Auriac att tänka utanför ramarna och lägga fram COMPAS-PCR-principen, ett litet paradigmskifte inom området molekylär fotokopiering.

I processen för att utföra DNA -baserad diagnos för laxfisk, särskilt identifiering av den närbesläktade öringen (Salmo trutta) och atlantlaxen (Salmo salar), Anglès d'Auriac kämpade för att separera dessa arter – inklusive hybrider mellan dem. Snabb och exakt identifiering skulle hjälpa till att förbättra flodens ekosystemövervakning och studier, eftersom identifiering av hybrider är viktigt för att uppskatta den ekologiska hälsan i avrinningsområden. Efter att ha använt COMPAS-PCR, Anglès d'Auriac kunde tillämpa en PCR -produktanalysmetod som kallas smältanalys med hög upplösning för identifiering av öring, Atlantlax och deras hybrider i ett test.

Anglès d'Auriac betonar dock att COMPAS-PCR-principen inte är begränsad till identifiering av fiskarter. Användning av nästan fullständigt kompletterande primers med samma sekvens kan gälla alla kopior som ligger intill varandra, i DNA-motiv av intresse som målsekvenser.

"DNA-repeterande sekvenser rapporteras utgöra mer än 50 % av det mänskliga genomet och finns i många "hushållnings"-genfamiljer, såsom 5S-ribosomalgenen som används i denna studie. de allmänna COMPAS-PCR-principerna hjälper till att utveckla nya DNA-amplifieringsstrategier med fördel av dessa upprepade DNA-strukturer, " avslutar Marc Anglès d'Auriac.