Forskare på Floridas campus vid The Scripps Research Institute (TSRI) har förbättrat en toppmodern genredigeringsteknik för att främja systemets förmåga att rikta in sig på, klippa ut och klistra in gener i mänskliga och djuriska celler – och bredda sätten CRISPR-Cpf1-redigeringssystemet kan användas för att studera och bekämpa mänskliga sjukdomar.

Professor Michael Farzan, medordförande för TSRI:s avdelning för immunologi och mikrobiologi, och TSRI Research Associate Guocai Zhong förbättrade effektiviteten hos CRISPR-Cpf1-genredigeringssystemet genom att införliva guide-RNA med "multiplexing"-kapacitet.

Guide-RNA är korta nukleinsyrasträngar som leder CRISPR-molekylsaxen till sina avsedda genmål. TSRI-upptäckten innebär att flera genetiska mål i en cell kan träffas av varje CRISPR-Cpf1-komplex.

"Detta system förenklar och avsevärt förbättrar effektiviteten av samtidig redigering av flera gener, eller flera platser av en enda gen, ", sade Zhong. "Detta kan vara mycket användbart när flera sjukdomsrelaterade gener eller flera platser för en sjukdomsrelaterad gen behöver riktas mot."

"Det här tillvägagångssättet förbättrar genredigering för ett antal applikationer, ", tillade Farzan. "Systemet gör vissa applikationer mer effektiva och andra applikationer möjliga."

Denna studie publicerades som ett avancerat onlinepapper i tidskriften Naturens kemiska biologi den 19 juni, 2017.

TSRI Advance gör CRISPR mer effektivt

Förkortning för "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, " CRISPR-genredigeringssystemet utnyttjar en gammal bakteriell immunförsvarsprocess. Vissa mikrober förhindrar virusinfektion genom att binda en bit av ett viruss främmande genetiska material i sitt eget DNA, att fungera som en mall. Nästa gång den virala sekvensen påträffas av mikroben, det känns igen omedelbart och skärs upp för bortskaffande med hjälp av två typer av RNA. Molekyler som kallas guide-RNA tillhandahåller kartan till inkräktaren, och CRISPR effektorproteiner fungerar som saxen som skär det isär.

Under de senaste fem åren, genredigeringssystemet CRISPR har revolutionerat mikrobiologin och förnyat förhoppningar om att genteknik så småningom kan bli en användbar behandling för sjukdomar.

Men tiden har avslöjat teknikens begränsningar. För en, genterapi kräver för närvarande användning av ett viralt skal för att tjäna som leveranspaket för det terapeutiska genetiska materialet. CRISPR-molekylen är helt enkelt för stor för att passa med flera guide-RNA i det mest populära och användbara virala förpackningssystemet.

Den nya studien från Farzan och kollegor hjälper till att lösa detta problem genom att låta forskare paketera flera guide-RNA.

Detta framsteg kan vara viktigt om genterapi ska behandla sjukdomar som hepatit B, sa Farzan. Efter infektion, hepatit B DNA sitter i leverceller, långsamt styra produktionen av nya virus, leder i slutändan till leverskador, cirros och även cancer. Det förbättrade CRISPR-Cpf1-systemet, med sin förmåga att 'multiplexa, " skulle kunna smälta virus-DNA mer effektivt, innan levern är oåterkallelig skadad, han sa.

"Effektivitet är viktigt. Om du modifierar 25 celler i levern, det är meningslöst. Men om du modifierar hälften av cellerna i levern, det är kraftfullt, ", sa Farzan. "Det finns andra bra fall - säg muskeldystrofi - där om du kan reparera genen i tillräckligt många muskelceller, du kan återställa muskelfunktionen."

Två typer av dessa molekylära saxar används nu i stor utsträckning för genredigeringsändamål:Cas9 och Cpf1. Farzan sa att han fokuserade på Cpf1 eftersom det är mer exakt i däggdjursceller. Cpf1-molekylen som de studerade kom från två typer av bakterier, Lachnospiraceae-bakterien och Acidaminococus sp., vars aktivitet tidigare har studerats i E. coli. En nyckelegenskap hos dessa molekyler är att de kan ta sina guide-RNA ur en lång sträng av sådant RNA; men det var inte klart att det skulle fungera med RNA producerat från däggdjursceller. Guocai testade denna idé genom att redigera en eldfluga bioluminescensgen i cellens kromosom. Det modifierade CRISPR-Cpf1-systemet fungerade som förväntat.

"Detta betyder att vi kan använda enklare leveranssystem för att styra CRISPR-effektorproteinet plus guide-RNA, ", sa Farzan. "Det kommer att göra CRISPR-processen mer effektiv för en mängd olika tillämpningar."

Ser fram emot, Farzan sa att Cpf1-proteinet måste förstås mer brett så att dess användbarhet för att leverera genterapivektorer kan utökas ytterligare.