Flytta dig, genredigerande proteiner – det finns en mindre, billigare, mer specifikt genteknikverktyg på blocket:DNAzymer – små DNA-molekyler som kan fungera som proteinenzymer.

Forskare vid University of Illinois Urbana-Champaign har utvecklat en teknik som, för första gången, tillåter DNAzymer att rikta in sig på och skära dubbelsträngat DNA, övervinna en betydande begränsning av tekniken. DNAzymer har använts i biosensing, DNA-beräkning och många andra applikationer. Dock, när det gäller genteknikapplikationer som genredigering eller genterapi, de har ställts inför en utmaning:DNAzymer har bara kunnat rikta sig mot platser på enkelsträngat DNA, medan DNA som kodar för gener i celler är dubbelsträngat. Forskarna publicerade sin nya teknik i Journal of the American Chemical Society .

"DNAzymer har många fördelar, inklusive högre stabilitet, mindre storlek och lägre kostnad än proteinenzymer. Dessa fördelar passar perfekt till kravet på genteknikverktyg, " sa studieledaren Yi Lu, professor i kemi vid Illinois. "Inga DNAzymer kunde förändra dubbelsträngat DNA förrän detta fungerar. Genom att få det att hända, vi öppnar dörren för DNAzymes att komma in i hela världen av genteknik."

I dubbelsträngat DNA, de två strängarna är specifikt ihopparade med komplementära sekvenser. För att göra det möjligt för DNAzymes att skära dubbelsträngat DNA, Illinois-teamet utvecklade en teknik som parar DNAzymer med hjälpmolekyler som kallas peptidnukleinsyror.

"PNA är ett mycket starkt DNA-bindemedel, tillräckligt stark för att binda till en sträng av det dubbelsträngade DNA:t trots att alla baser redan är parade med den andra strängen, " sa Mingkuan Lyu, en doktorand och uppsatsens första författare. "När den här processen väl inträffar, en sträng av det dubbelsträngade DNA:t kommer att upptas av PNA, och den andra strängen kommer att exponeras som enkelsträngat DNA, tillgängligt för DNAzymet att interagera."

Teamet visade först tekniken, kallas PNA-assisterad dubbelsträngad DNA-nickning av DNAzymer, eller PANDA, på en syntetisk testsekvens för att bevisa att det fungerade att klippa en eller båda strängarna av ett dubbelsträngat DNA-mål. De testade också PANDAs förmåga att skilja en specifik målsekvens från liknande sekvenser. Det här är viktigt, forskarna sa, eftersom oavsiktlig aktivitet utanför målet är en av utmaningarna som har begränsat de kliniska tillämpningarna av proteinbaserade genredigeringstekniker, som CRISPR.

"I CRISPR-Cas9, guide-RNA:t ansvarar för skräddarsydd måligenkänning, men i PANDA, både DNAzymet och PNA är det. Därför, det finns en inneboende "dubbelkontroll"-mekanism i PANDA, göra det strängare i målspecificitet, ", sade Lyu. "Vi testade specificiteten genom att mutera bara en bas inom målet. Det visade sig att i de flesta fall, PANDA kan känna igen denna lilla förändring och vägra skära det felaktiga målet."

En annan fördel med PANDA är dess ringa storlek - PNA och DNAzyme är tillsammans cirka fem gånger mindre än CRISPR-Cas9-komplexet, Lu sa - att tillåta den att komma åt trånga platser inom en kromosoms tätt packade DNA som ett stort protein inte kunde nå.

Nästa, forskarna planerar att undersöka PANDA-systemets prestationsinriktade gener av intresse i levande celler. De planerar också att utöka katalogen av gener som PANDA-systemet kan rikta in sig på.

"Inriktningssekvenserna kan enkelt ändras och anpassas för specifika applikationer, "Därför kan PANDA-systemet fungera som ett nytt alternativt verktyg för ett brett utbud av genteknik och andra biokemiska och biotekniska tillämpningar."