Integrerade membranproteiner, eller IMP, är en stor klass av proteiner som spelar avgörande roller i många cellulära processer, inklusive katalys av disulfidbindningar, som är avgörande för funktionen och stabiliteten hos många proteiner såsom antikroppar, som har betydande terapeutisk potential.
Men IMP är i sig hydrofoba och har därför låg löslighet i vattenhaltiga miljöer. Deras naturliga miljö är inom lipiddubbelskiktsmembranet i en cell, vilket gör det svårt att studera deras struktur och funktion.
En tidigare rapporterad metod som involverade standardrekombinanta DNA-tekniker och några nya designprinciper gjorde det möjligt för ett team av Cornell kemiingenjörer att enkelt och billigt tillverka stora mängder funktionella IMPs – allt utan användning av starka kemikalier eller rengöringsmedel, som vanligtvis används idag. Det laget, ledd av Matt DeLisa, William L. Lewis professor i teknik vid Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, har nu använt den proteintekniska metoden för att omvandla ett membranbundet enzym till en vattenlöslig biokatalysator som fungerar direkt i den vattenhaltiga inre cellen.
"Du kan göra om dessa knepiga proteiner, gör dem vattenlösliga, och kanske verkligen överraskande, de kan fortsätta att katalysera sina naturliga biologiska reaktioner, sa DeLisa, huvudutredare för "En vattenlöslig DsbB-variant som katalyserar bildning av disulfidbindningar in vivo, " publicerad 19 juni i Natur kemisk biologi .
"Så vitt vi vet, detta är det första exemplet på att skapa en vattenlöslig IMP som behåller sin naturliga katalytiska aktivitet men gör det i en helt ny cellulär miljö, "DeLisa sa." Och eftersom det är en genetiskt konstruerad konstruktion, det kan uttryckas som alla andra lösliga proteiner med mycket liten ansträngning eller svårighet. "
Första författaren är Dario Mizrachi, tidigare postdoktor i kemi- och biomolekylteknik som nu är biträdande professor vid Brigham Young University. Medarbetare inkluderade Michael-Paul Robinson, doktorand i kemi- och biomolekylär teknik, och Mehmet Berkmen från New England Biolabs.
Gruppens tidigare arbete beskrev en metod som de kallade SIMPLEx (Solubilization of Integral Membrane Proteins with High Levels of Expression), för att skydda IMP från vatten och möjliggöra produktion av stora mängder av dessa svårtillverkade proteiner. Genom att använda rekombinanta DNA-tekniker, de sytt ihop ett artificiellt membranprotein med en identitetskris - ett som bibehåller sin biologiska funktion, men tror att det är lösligt i vatten.
Detta senaste arbete är den första tillämpningen av den tekniken. Gruppen använde sina identitetsväxlade IMP:er för att göra disulfidbindningar, en typ av posttranslationell modifiering som förekommer i många proteiner och som påverkar nästan alla aspekter av normal cellbiologi och patogenes.
Gruppen riktade in sig på det bakteriella integrala membranenzymet DsbB, en central biokatalysator vid bildning av disulfidbindningar, även om DeLisa tror att tekniken är överförbar till otaliga andra membranproteiner.
Med hjälp av SIMPLEx -metoden, gruppen omvandlade membranbunden DsbB till en vattenlöslig biokatalysator som lätt kunde uttryckas i E. coli-cytoplasman, där det skapade disulfidbindningsbildning i en rad proteinmål.
Disulfidbindningar är nyckelspelare i många terapeutiska proteiner, såsom monoklonala antikroppar. Många cancerläkemedel använder dessa molekyler, som kan efterlikna eller förstärka immunsystemets attack på tumörceller.
Möjligheten att ta ut katalysatorn ur lipidmembranet och sätta den i cytoplasman, DeLisa sa, gör det möjligt för forskare att göra dessa antikroppar på potentiellt mer gynnsamma platser i cellen.
"Vi kunde göra denna väg i cytoplasman ... [eller] vi kunde flytta allt till ett annat subcellulärt fack som periplasman, eller potentiellt ta hela vägen ut ur cellen och rekonstituera den i ett cellfritt system, "DeLisa sa." Poängen är, vi skapar en enorm mängd flexibilitet när det gäller att skapa dessa bindningar genom att i huvudsak förvandla ett membranprotein till ett lösligt enzym."
