En ny metod för att förbättra högavkastningen, hög renhet, högaktivitetsrening av komplexa proteiner med 10 till 500 gånger har utvecklats vid University of Alabama i Birmingham.
"Denna nya metod erbjuder ett antal avgörande fördelar för både forskare och läkemedelsindustrin, "sa Dmitry Vassylyev, professor i biokemi och molekylär genetik vid UAB. "Det är potentiellt det mest effektiva och universella verktyget för studier med hög genomströmning av många viktiga biologiska system och kan hjälpa storskalig produktion av terapeutiska proteiner."
Högt utbyte, hög renhet, högaktivitetsrening, eller HHH, är den heliga gralen för strukturella och industriella tillämpningar. UAB:s enstegsreningssystem övervinner betydande svagheter i nuvarande kommersiellt tillgängliga reningssystem, Vassylyev säger.
I ett papper publicerat i Förfaranden från National Academy of Sciences , Vassylyev och UAB -kollegor testade sin reningsmetod för affinitetskromatografi CL7/Im7 på fem traditionellt utmanande biologiska molekyler, inklusive prokaryota och eukaryota membranproteiner och multisubunit-DNA/RNA-bindande proteiner.
"En anmärkningsvärd illustration av överlägsen prestanda för CL7/Im7 -tillvägagångssättet, "skrev de i PNAS -rapporten, "är att CNX -proteinprovet, som vi renade på några timmar och från bara några gram E. coli -celler, skulle ha ett marknadsvärde på cirka $ 400, 000, enligt nuvarande kommersiella priser. "
Systemet är enkelt och återanvändbart - UAB -forskarna har återställt och återanvänt sin affinitetskromatografikolonn mer än 100 gånger, bibehåller nästan 100 procent bindningskapacitet.
Metoden är baserad på den anmärkningsvärt starka bindningsaffiniteten mellan bakterietoxiner som kallas koliciner och deras specifika immunitetsproteiner. En värdbakterie kan släppa ut ett kolicintoxin - som Colicin E7 DNAse - som kan döda andra bakterier. Inuti värdbakterierna, CE7 är bunden med Immunity Protein 7, eller Im7; denna bindning förhindrar självförvållad förstörelse.
Bindningsaffiniteten för CE7/Im7 är nästan lika stark som en kovalent bindning, och den är fyra till sju storleksordningar högre än andra affinitetskromatografianaloger. Vassylyev och kollegor gjorde en inaktiv variant av CE7, kallas CL7, som inte har någon DNas -aktivitet men behåller full bindningsaffinitet för Im7. De gjorde också en variant av Im7 som möjliggör effektiv koppling till agarospärlor.
Med hjälp av genetiska tekniker, CL7 -taggen sätts enkelt in i gener för målproteiner, i både eukaryoter och prokaryoter. Dessa gener kan flyttas till en expressionsvektor, eller det märkta målproteinet kan uttryckas från nativa celler utan amplifiering.
När ett råproteinlysat hälls genom en kolonn fylld med Im7-agarospärlorna, CL7 -taggarna på målproteinet binder till Im7. En konstruerad proteasplats används för att frigöra målproteinet från den bundna CL7 -taggen. Detta möjliggör ettstegs HHH-rening, med 97 till 100 procent renhet, för målproteinerna som testats av UAB -forskarna.
I kontrast, de mest publicerade reningsscheman för dessa utmanande proteiner är flerstegs, flera dagars protokoll, med lägre avkastning. Vassylyev, en proteinkristallograf, säger att få stora mängder rent protein är det hastighetsbegränsande steget i kristallografi, fick honom att börja söka efter en bättre metod för fyra år sedan.
De utmanande proteinerna som renades i PNAS -rapporten var bakteriellt Thermus thermophilus RNA -polymeras och Mycobacteria tuberculosis RNA -polymeras, som är multisubenhetsproteiner; YidC -membranintegras, ett Bacillus halodurans membranprotein; calnexin, eller CNX, ett humant transmembranchaperonprotein; och två nukleinsyrabindande proteiner, multisubunit -kondensinproteinkomplexet av Salmonella typhimurium som viker och komprimerar cellulärt DNA, och komplexet för mänsklig ombyggnad och avståndsfaktor, RSF, vilket är inblandat i förmedling av nukleosomaggregat.
Det enkla reningssystemet är också tillämpligt på nedrullningsförsök och kinetisk aktivitet eller bindningsanalyser, såsom ytplasmonresonans. Det kan också hjälpa till med kryo-elektronmikroskopi.
