1969, forskaren Michael Cashel analyserade de föreningar som produceras av svältade bakterier när han märkte två fläckar som visas på hans kromatogram som genom en magi. I dag, vi känner till en av dessa "magiska fläckar, "som forskare kallar dem, som guanosintetrafosfat, eller ppGpp för kort. Vi förstår också att det är en signalmolekyl som finns i praktiskt taget alla bakterier, hjälper till att ställa in celltillväxt och storlek baserat på näringstillgång.

Och ändå, trots årtionden av studier, exakt hur ppGpp reglerar bakterietillväxt har förblivit ganska mystiskt. Delving kräver ytterligare en mer omfattande lista över de molekyler som ppGpp binder för att utöva dess effekter.

Nu, medarbetare från MIT:s avdelningar för biologi och kemi har utvecklat en metod för att göra just det, och använde sitt nya tillvägagångssätt för att identifiera över 50 ppGpp -mål i Escherichia coli - ungefär hälften som inte hade identifierats tidigare. Många av dessa mål är enzymer som krävs för att producera nukleotider, byggstenarna i DNA och RNA. Under tider då bakterierna inte har tillräckligt med näringsämnen för att växa och dela sig normalt, forskarna föreslår att ppGpp hindrar dessa enzymer från att skapa nya nukleotider från grunden, hjälper cellerna in i ett vilande tillstånd.

"Med små molekyler eller metaboliter som ppGpp, det har historiskt varit svårt att avgöra vilka proteiner de binder, "säger Michael Laub, professor i biologi, en Howard Hughes Medical Institute -utredare, och seniorförfattaren till studien. "Detta har varit ett svårlöst problem som har hållit fältet tillbaka en tid, men vårt nya tillvägagångssätt låter dig spika fast de troliga målen på några veckor. "

Postdoc Boyuan Wang är den första författaren till studien, som visas i Natur kemisk biologi den 17 december.

Den magiska platsen

Sedan ppGpp upptäcktes för nästan 50 år sedan, det har visat sig undertrycka DNA -replikation, transkription, översättning, och olika metaboliska vägar. Det sätter bromsarna på celltillväxt och tillåter bakterier att bestå inför svält, påfrestning, och antibiotika. Dess inflytande över många regleringsprocesser har förblivit något av ett mysterium, dock - trots allt, det modulerar inte bara en enda väg utan samordnar flera operationer samtidigt för att orkestrera en massavstängning av cellen.

För att urskilja vilka proteiner ppGpp binder för att åstadkomma en så omfattande förändring, forskarna byggde vad de kallar "fångstföreningar" som innehåller ppGpp, så att de kan fiska ut sina mål från bakterieextrakt. Dessa föreningar inkluderade en fotoreaktiv tvärbindare som spärrade fast på proteinerna av intresse i närvaro av ljus, och ett biotinhandtag som hjälpte forskarna att dra ut proteinerna för att identifiera dem. Viktigast, de förenades med ppGpp på ett sådant sätt att de inte skulle störa dess förmåga att binda till sina mål. Denna metod är mer effektiv och exakt jämfört med mer traditionella sätt att skilja ppGpp -mål, som är mycket svårare och saknar känslighet.

"Vår metod löser dessa problem eftersom du inte längre behöver göra sådana arbetsintensiva protokoll för att identifiera ppGpp-mål-och det fungerar även i bakterier bortom E. coli, "säger Wang." Även om ppGpp är vanligt bland många bakteriearter, det verkar utöva sina effekter genom olika mekanismer, som komplicerar saker. Våra fångstföreningar ger ett sätt att reda ut denna mångfald, och kort sagt. "

Sätter bromsarna på nukleotidproduktion

Även om de 56 ppGpp -målen som Wang identifierade i sin skärmkontroll kontrollerar en myriad av cellulära processer, han gick in på enzymet PurF - som initierar biosyntesen av purinnukleotider som bär adenin- och guaninbaser, även känd som A och G.

När bakterier stressas eller svälter, de går in i ett vilande tillstånd för att överleva. Men det räcker inte med att begränsa översättning och transkription. nukleotider genereras fortfarande och kommer att byggas upp om deras syntes inte sätts på paus. Celler kan bygga nukleotider på ett av två sätt:antingen genom att rädda befintliga material eller börja helt från början. PurF startar det första steget i den senare processen som leder till A- och G -nukleotiderna. Dock, när ppGpp binder till PurF, det får enzymet att ändra sin form, som hindrar den från att göra sitt jobb, vilket minskar nukleotidproduktionen i cellen.

"Detta är första gången som ett enzym som är involverat i den specifika vägen eller funktionen har identifierats som ett ppGpp -mål, "Säger Wang." Om du begränsar konsumtionen av nukleotider men inte deras produktion, nukleotidpoolen kommer att explodera, vilket inte är bra för cellen. Så vi har visat att ppGpp faktiskt också löser detta problem. "

Förutom PurF och andra enzymer som krävs för nukleotidproduktion, forskarna märkte att ppGpp också binder till många GTPase -enzymer som är involverade i translation. Detta kan tyda på en felsäker mekanism som bromsar översättningen genom att slå på flera, liknande enzymer på ett nästan överflödigt sätt inför svält.

När Wang fortsätter att förfina sin metod, han siktar på att öka dess specificitet och se till att hans fångstföreningar binder till exakt samma proteiner som de skulle inne i en levande cell. Han hoppas också att screena för ppGpp -bindande proteiner i andra bakterier, inklusive patogener som förlitar sig på ppGpp för att överleva inom sina värdar och sprida tillstånd som tuberkulos.

"Detta är ett spännande kemiskt tillvägagångssätt för att bättre förstå funktionen hos en länge studerad bevarad signalmolekyl hos bakterier, "säger Jue Wang, professor i bakteriologi vid University of Wisconsin i Madison, som inte var inblandad i studien. "Deras fynd och tekniker är mycket relevanta för många andra bakterier, och kommer att förbättra kunskapen om hur bakterier använder denna kritiska signalmolekyl för att förmedla allt från att överleva i människans tarm till att orsaka sjukdom. "

Laub tillägger:"Vi upptäcker fortfarande nya nukleotidbaserade signalmolekyler i bakterier även idag, och var och en av dem kan så småningom härledas på ett liknande sätt för att identifiera deras bindande partner. "

Denna artikel publiceras på nytt med tillstånd av MIT News (web.mit.edu/newsoffice/), en populär webbplats som täcker nyheter om MIT -forskning, innovation och undervisning.