Med en ny teknik för att skapa ett spektrum av glödande färgämnen, kemister jagar inte längre regnbågar.

Att byta ut specifika kemiska byggstenar i fluorescerande molekyler som kallas rhodaminer kan generera nästan vilken färg forskare önskar - ROYGBIV och mer, forskare rapporterar 4 september, 2017 i tidningen Naturmetoder .

Arbetet erbjuder forskare ett sätt att medvetet justera egenskaperna hos befintliga färgämnen, gör dem djärvare, ljusare, och mer cellgenomsläpplig också. En sådan utökad palett av färgämnen kan hjälpa forskare att bättre belysa cellernas inre funktion, säger studieledaren Luke Lavis, en gruppledare vid Howard Hughes Medical Institutes Janelia Research Campus i Ashburn, Virginia. Hans team lyste upp cellkärnor, fick larvfruktflugans hjärnor att lysa, och framhävde visuella cortexneuroner hos möss som hade små glasfönster inpassade i deras skallar.

Forskare brukade koka ihop olika färgämnen mestadels genom försök och misstag, säger Lavis. "Nu, vi har listat ut reglerna, och vi kan göra nästan vilken färg som helst." Hans teams metod kunde tillåta kemister att syntetisera hundratals olika färger.

En ljus historia

Tills för cirka 20 år sedan, forskare förlitade sig på kemiska fluorescerande färgämnen för att göra biologiska molekyler synliga. För att kika in i celler, färgning av organeller, och andra avbildningsexperiment, "kemin var kung, " skrev Lavis i en 13 juli, 2017 års perspektiv i tidskriften Biokemi . Och då, kungen sparkades av tronen – av ett glödande grönt manetprotein som kallas GFP.

1994, forskare rapporterade användningen av ett genetiskt trick för att tackla GFP, det gröna fluorescerande proteinet, på andra cellulära proteiner; det är som att tvinga proteinerna att hålla en glödstift. Det tricket gav forskare ett enklare sätt att spåra proteiners rörelser i mikroskop – utan att använda dyra syntetiska färgämnen. Innovationen slog igenom inom området biologisk avbildning. Under 2007, forskarnas blandning av GFP och två andra fluorescerande proteiner lät dem måla musneuroner en parad av livfulla färger i en teknik som kallas "Brainbow". Ett år senare, upptäckten och utvecklingen av GFP fick Nobelpriset i kemi för tre vetenskapsmän, inklusive avlidne Roger Tsien, en HHMI-utredare.

Men GFP har också några mörka sidor. Det är en relativt klumpig molekyl byggd av den begränsade uppsättningen naturliga aminosyror. Så GFP är inte alltid tillräckligt ljus för att avslöja vad forskare försöker se.

Så forskare vände tillbaka till kemi. Forskare hade utvecklat banbrytande mikroskop och nya tekniker för att märka cellinnehåll, Lavis säger, men färgämnena för att markera molekyler inuti celler satt fortfarande fast på artonhundratalet. Hans team fokuserade på rhodaminer, eftersom de är särskilt ljusa och cellgenomsläppliga - så de glider lätt in i cellerna och får dem att glöda. Men trots att de har arbetat med rhodaminer i mer än 100 år, kemister hade bara skapat några dussin färger, och de flesta var liknande nyanser från grönt till orange.

Tills nyligen, att göra nya rhodaminer var inte lätt. Forskare använde fortfarande tekniker från kemins tidigaste dagar, kokande kemiska ingredienser i svavelsyra. Detta tvingar molekylerna att länka samman i vad som kallas en kondensationsreaktion. Att blanda in olika byggstenar kan ge nya och ovanliga färgämnen. Men ingredienserna måste vara tillräckligt hårda för att överleva det kokande syrabadet – vilket inte lämnade många alternativ.

Få det att glöda

Under 2011, Lavis team utvecklade ett nytt sätt att mixtra med rhodamines struktur, under mildare förhållanden. Med hjälp av en reaktion utlöst av metallen palladium, forskarna kunde hoppa över syrasteget och konstruera färgämnen med mer komplicerade byggstenar än vad som använts tidigare.

Detta snällare, mildare tillvägagångssätt öppnade dörren till en bred ny värld av färgämnen, och Lavis team dök in. Fyra år senare, de avslöjade Janelia Fluor färgämnen, fluorescerande molekyler upp till 50 gånger ljusare än andra färgämnen, och mer stabil också. Hemligheten bakom Janelia Fluor-färgämnena är ett litet fyrkantigt bihang som kallas en azetidinring - en struktur som endast är möjlig genom Lavis nya kemi.

Forskare kan använda en mängd olika strategier för att få de ljusa färgämnesmolekylerna till det protein de vill studera. Sedan, de kan nollställa det upplysta proteinet, och se hur den vickar runt och interagerar med andra molekyler - utan den vanliga bakgrunden.

"För oss, det var en total revolution inom området för enkelmolekylär avbildning, " säger molekylärbiolog Xavier Darzacq vid University of California, Berkeley. Innan du använder Janelia Fluor färgämnen, de fluorescensmärkta transkriptionsfaktorproteinerna som hans team studerade var för svaga för att fångas i skarpa bilder. Forskare var tvungna att hålla kameraslutaren öppen i 10 millisekunder för att samla in tillräckligt med ljus. Det är tillräckligt länge för att proteiner ska vandra, så att bilden skulle bli suddig - som ett fotografi av ett snurrigt litet barn. Men Janelia-färgämnena är tillräckligt ljusa för att hans team kan fånga molekyler i aktion på bara en millisekund, säger Darzacq. Sådana snabba ögonblicksbilder har gjort det möjligt för hans team att göra laboratorieexperiment som han beskriver som "helt enkelt otänkbart för några år sedan."

Nu, Lavis grupp har kommit på hur man finjusterar sina fluorescerande färgämnen, genom att justera rhodamines struktur ytterligare. Rhodaminer har en grundläggande fyrringad design med grupper av atomer som sticker ut från olika delar av ringarna. I tidigare arbeten, forskarna utvecklade strategier för grovjustering av färgämnen - klipp ut ett helt bihang här, och du kan göra ett grönt färgämne. Stoppa in en kiselatom där, och du har rött. Lavis upptäckte att genom att försiktigt placera bara några få nya atomer i färgämnesstrukturen, färgämnenas färg och kemiska egenskaper kan också finjusteras, tillåter många nyanser av grönt från en enda ställning. Det är som att gå från det klassiska åttapaketet med kritor till jumbolådan med 64.

I en separat tidning, publicerad 9 augusti, 2017 i tidningen ACS Central Science , teamet beskrev ett sätt att modifiera färgämnesstrukturens bottenring.

"Det viktiga är att det hela är modulärt och rationellt, " säger Lavis. Välj rätt atomer, han förklarar, och kemister kan konstruera färgämnen med nästan vilken egenskap de vill.

Hans grupp ympade olika kemikalier på rhodaminer, och analyserade sedan de nya färgämnenas egenskaper. "Ingen hade någonsin tittat på rhodaminer på ett sådant här systematiskt sätt tidigare, " säger huvudmedförfattaren Jonathan Grimm, senior forskare på Janelia.

Färgämnena syntetiseras i ett enda steg med billiga ingredienser, säger Lavis. Det gör färgämnena billigare än kommersiella alternativ - öre per flaska. Den låga kostnaden har gjort det möjligt för hans team att dela sitt arbete med forskare runt om i världen. Lavis, Grimm, och kollegor har nu skickat tusentals flaskor till hundratals olika laboratorier.

"De här färgämnena är en komplett spelomvandlare, " säger Ethan Garner, en bakteriecellsbiolog vid Harvard University som har använt dem för att spåra vägen för enskilda molekyler i sitt labb. Nackdelen hade varit att forskarna inte hade så många olika färger att välja mellan. Men nu, han säger, med Lavis arbete, "De kan faktiskt täcka hela spektralområdet."