Vad händer i en cell när genetisk information översätts till proteiner? För att studera denna process, forskare studerar en viss biomolekyl inuti cellen:messenger ribonukleinsyra, mRNA för kort. Denna biomolekyl spelar en stor roll i alla cellulära processer-och det är också fokus för gemensam forskning som utförs av två grupper vid Cells-in-Motion Cluster of Excellence vid Münster University. En av grupperna består av biokemister och leds av prof. Andrea Rentmeister; den andra består av molekylära biologer och leds av doktor Sebastian Leidel.

I sitt tvärvetenskapliga samarbete forskarna har lyckats för första gången att kemo-enzymatiskt märka en viktig förändring i budbärar-RNA-den så kallade m6A-modifieringen-och därefter upptäcka det med hjälp av moderna molekylära biologiska metoder. "Detta nya tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att lokalisera modifieringar i mRNA med en större noggrannhet än någonsin tidigare, säger Andrea Rentmeister, en professor vid Cluster of Excellence som ledde studien. Att veta var och i vilken utsträckning m6A -modifieringar inträffar kan hjälpa forskare att förstå denna modifiering i fysiologiska och patologiska processer. Studien har publicerats i Angewandte Chemie (International Edition) tidskrift.

DNA:s genetiska information transkriberas till messenger -RNA i en process som kallas transkription. Efter transkription, mRNA transporterar den genetiska informationen från cellkärnan in i cytoplasman. Där, det fungerar som en vägledning för produktion av proteiner. Proteiner är arbetshästarna som utför alla cellulära uppgifter.

Som dubbelsträngat DNA, enkelsträngat RNA består av en kedja av så kallade nukleotider. I RNA, dock, det finns också många kemiska förändringar av dessa nukleotider - kända som RNA -modifieringar. Dessa modifieringar sker efter att den genetiska informationen har lästs. I processen, enkla atomarrangemang - metylgrupperna - är fästa vid nukleotiderna. "En ändring som för närvarande diskuteras hårt är N6-metyladenosin, känd som m6A för kort, "säger Andrea Rentmeister. Den här modifieringen är mycket intressant eftersom den verkar vara ansvarig för en rad biologiska processer inklusive dygnet runt. Den verkar också spela en roll i patologiska processer, till exempel vid vissa former av cancer eller vid virusinfektioner.

Biokemister märkte RNA-modifieringar kemo-enzymatiskt

För att få en bättre förståelse av m6A, forskarna sökte hitta var exakt i mRNA modifieringen befann sig. För att märka molekyler, biologer använder ofta antikroppar som fäster sig vid det. Denna metod har sina begränsningar, dock; antikropparna kan binda inte bara till modifieringarna av mRNA, men också till närliggande nukleotider. Detta gör det svårt att exakt hitta ändringarna. "Vi ville nu utföra märkningen med ett kemiskt tillvägagångssätt, "Andrea Rentmeister förklarar. För första gången, hon och hennes team använde propargylgrupper, en något längre kolväterest.

Forskarna kopplade propargylgrupperna till enzymets cosubstrat, och kombinerade alla tre komponenterna med mRNA -molekyler i provröret. I sin kemiska struktur, propargyl liknar en naturlig molekyl bunden av ett metyltransferas. Metyltransferaser är å sin sida enzymer som är ansvariga för modifieringen av mRNA. Således, metyltransferaserna kunde överföra propargylgruppen till RNA. Med hjälp av så kallad klickkemi, forskarna kunde isolera och rena RNA med propargylgrupper.

Molekylära biologer upptäckte RNA -modifieringar med hjälp av nästa generations sekvensering

För att upptäcka de specifikt märkta ändringarna, forskarna använde ett speciellt enzym för att transkribera mRNA tillbaka till DNA. Den resulterande DNA -strängen är en kopia av det tidigare RNA och kan undersökas med molekylära biologiska metoder. Forskarna sekvenserade denna nysyntetiserade DNA -sträng, läsa sekvenserna av nukleotider. De använde nästa generations sekvensering, vilket gjorde det möjligt för dem att bestämma sekvenserna av nukleotider extremt effektivt. "Denna metod gör att vi kan analysera tusentals sekvenser parallellt, ”förklarar Sebastian Leidel.

Eftersom forskarna hade märkt modifieringarna med propargylgrupperna, de enzymer som är nödvändiga för omskrivningen av RNA som stoppats. Som ett resultat, de misslyckades med att transkribera RNA tillbaka till DNA. "Enzymerna upphörde med någon aktivitet på de märkta platserna och genererade någon form av stoppsignal, "säger Katja Hartstock, en kemist och huvudförfattare till historien. Forskarna kunde bestämma dessa stoppsignaler under sekvensering, vilket innebar att de kunde upptäcka de platser där mRNA -modifieringen inträffade.

Efter de första experimenten i provröret, forskarna tillämpade sin nya metod i en kultur av mänskliga epitelceller - HeLa -celler. Forskarna matade cellerna med en propargylmärkt så kallad aminosyraprekursor, som cellerna "åt, "och därefter började märkningen. Som redan fastställts i provröret, propargylgrupperna anslöt sig till RNA med hjälp av metyltransferaser och möjliggjorde detektion av mRNA -modifieringsställen genom nästa generations sekvensering.

Nästa steg forskarna vill ta är att tillämpa sin metod på levande organismer för att studera betydelsen av modifieringen inom deras utveckling. Zebrafiskar är väl lämpade för detta ändamål eftersom de utvecklas mycket snabbt och modifieringarna transkriberas därför snabbare - och tas också bort igen snabbare.