Varje cell i kroppen innehåller tusentals olika proteinmolekyler och de kan ändra denna sammansättning när de blir inducerade att utföra en viss uppgift eller omvandlas till en annan celltyp. Att förstå hur celler fungerar beror på proteomik, förmågan att mäta alla förändringar i cellens proteinkomponenter.

I en ny tidning publicerad i tidningen Analytisk kemi , Martin Wühr och kollegor vid Princeton Universitys institution för molekylärbiologi beskrev en förbättrad metod för att exakt räkna proteinerna som finns i en cell under olika omständigheter.

Det grundläggande verktyget för att räkna proteiner är en maskin som kallas masspektrometer. Cellprover kan köras genom denna typ av instrument ett i taget, men detta är mödosamt och det kan vara svårt att upptäcka några förändringar mellan olika prover. Ett alternativt tillvägagångssätt är att märka alla proteiner i ett visst prov med en unik "isobarisk" tagg. Flera prover - upp till 11 - kan sedan blandas ihop och köras genom masspektrometern samtidigt, med den isobära taggen som fungerar som en identifierande streckkod som berättar för forskaren vilket prov proteinet ursprungligen kom ifrån. Detta påskyndar saker och gör det lättare att kvantifiera eventuella förändringar i proteinsammansättningen i olika prover.

"Dock, med den enklaste versionen av isobarisk märkning, känd som TMT-MS2, det finns stora svårigheter att skilja riktiga signaler från bakgrundsbrus, "Wühr förklarar." Det gör avläsningarna opålitliga och endast halvkvantitativa. "

En mer komplex version av isobarisk märkning, kallas TMT-MS3, kan förbättra detta signal-till-brusproblem, men det är långsammare och mindre känsligt. Dessutom, den förlitar sig på en mycket dyrare typ av masspektrometer utanför de flesta forskares räckvidd.

Medan han var postdoc vid Harvard University, Wühr utvecklade ett annat tillvägagångssätt för isobarisk märkning som löste signal-till-brus-problemet samtidigt som det förblev kompatibelt med billigare, allmänt tillgängliga masspektrometrar. Men tekniken - känd som TMTc - var inte utan sina egna problem, särskilt en brist på precision som gjorde det svårt att få konsekventa resultat.

I deras senaste Analytisk kemi papper, Wühr och två av hans doktorander, Matthew Sonnett och Eyan Yeung, beskrev en förbättrad version av TMTc som de kallade TMTc+. Genom att ändra hur cellproverna förbereds och ändra datoralgoritmen som extraherar data från masspektrometern, Wühr och kollegor kunde ta itu med många av de begränsningar som är förknippade med de olika metoderna för isobarisk märkning.

"TMTc+ -metoden är i ett slags sweet spot jämfört med de andra metoderna, "Wühr säger." Det ger utmärkt mätnoggrannhet och precision, det är minst lika känsligt som någon annan metod, och det är kompatibelt med cirka tio gånger fler masspektrometrar än TMT-MS3. "

Naturligtvis, Wühr säger, det finns fortfarande utrymme för förbättringar. TMTc+ tillåter endast högst 5 prover att köras samtidigt, och detekteringen av proteiner i dessa prover är relativt ineffektiv. Båda dessa problem kan lösas genom att utveckla nya typer av isobariska taggar. "Vi måste utforska det kemiska utrymmet för dessa taggar och hitta dem som fungerar riktigt bra, "Säger Wühr." För detta ändamål, vi har inlett ett samarbete med Carell -gruppen, experter på organisk kemi vid LMU München, och har redan publicerat ett bevis på princippapper. Så småningom, dessa ansträngningar bör leda till ett tillvägagångssätt som gör det möjligt för forskare att räkna varje protein i en cell när det ändrar form och funktion. "