För första gången, forskare från ASU:s School of Molecular Sciences i samarbete med kollegor från Albert Einstein College of Medicine i New York City har tagit ögonblicksbilder av kristallstrukturer av mellanprodukter i den biokemiska vägen som gör att vi kan andas.

Publicerad idag i Förfaranden från National Academy of Sciences — Ögonblicksbild av en syremellanprodukt i den katalytiska reaktionen av cytokrom c-oxidas — deras resultat ger viktiga insikter i det sista steget av aerob andning.

"Det krävs ett team för att genomföra ett så sofistikerat experiment, " förklarar SMS:s docent Alexandra Ros som, tillsammans med sin doktorand Austin Echelmeier och tidigare praktikanten Gerrit Brehm, utvecklat den hydrodynamiska fokuseringsblandaren som gör dessa experiment möjliga.

Mixern är en mikrofluidisk enhet, som är högupplöst, 3D-tryckt och möjliggör att två strömmar av syremättad buffert kan blanda perfekt med en central ström innehållande bovint cytokrom c-oxidas (bCcO) mikrokristaller. Detta initierar en katalytisk reaktion mellan syret och mikrokristallerna.

I början

Denna forskning inleddes av ett samtal mellan SMS:s professor Petra Fromme, chef för Biodesign Institutes Center for Applied Structural Discovery (CASD), Raimund Fromme, SMS -docent, och professor Denis Rousseau från Albert Einstein College of Medicine i New York City som arbetar med strukturen av cytokrom c -oxidas, ett nyckelenzym involverat i aerob andning.

Cytokrom c-oxidas (CcO) är det sista enzymet i den respiratoriska elektrontransportkedjan av celler som finns i mitokondriella membranet. Den tar emot en elektron från var och en av fyra cytokrom c-molekyler, och överför dem till en syremolekyl (två atomer), omvandla det molekylära syret till två molekyler vatten.

Forskare vid CASD inklusive ASU:s Richard Snell professor i fysik, John Spence, hjälpte till att banbryta en ny teknik som kallas tidsupplöst seriell femtosekund (miljondels miljarddels sekund) kristallografi (TR-SFX). Denna teknik drar fördel av en röntgenfri elektronlaser (XFEL) vid Department of Energys (DOE) SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford.

SFX är en lovande teknik för bestämning av proteinstruktur, där en flytande ström innehållande proteinkristaller skärs med en högintensiv XFEL-stråle som är en miljard gånger ljusare än traditionella synkrotronröntgenkällor.

Medan kristallerna diffrakterar och omedelbart efter förstörs av den intensiva XFEL -strålen, de resulterande diffraktionsmönstren kan registreras med detektorer av den senaste tekniken. Kraftfulla nya dataanalysmetoder har utvecklats, tillåta ett team att analysera dessa diffraktionsmönster och få elektrondensitetskartor och detaljerad strukturell information om proteiner.

Metoden är särskilt tilltalande för svårkristalliserade proteiner, såsom membranproteiner, eftersom det ger högupplöst strukturell information från små mikro- eller nanokristaller, vilket minskar bidraget från kristalldefekter och undviker tråkig (om inte omöjlig) tillväxt av stora kristaller som krävs vid traditionell synkrotronbaserad kristallografi.

Denna nya "diffraktion före förstörelse" -metod har öppnat nya vägar för strukturell bestämning av ömtåliga biomolekyler under fysiologiskt relevanta förhållanden (vid rumstemperatur och i frånvaro av kryoskyddande medel) och utan strålskador.

CcO reducerar syre till vatten och utnyttjar den kemiska energin för att driva proton (positivt laddad väteatom) omlokalisering över det inre mitokondriella membranet genom en tidigare olöst mekanism.

Sammanfattningsvis, TR-SFX-studierna har möjliggjort strukturell bestämning av en nyckelsyremellanprodukt av bCcO. Resultaten av teamets experiment ger ny inblick i mekanismen för protonförflyttning i koenzymet jämfört med den i bakteriella CcO, och banar väg för bestämning av strukturerna för andra CcO-intermediärer, liksom övergående arter som bildas i andra enzymreaktioner.