Forskare från Nanyang Technological University, Singapore (NTU Singapore) har pekat ut hur en speciell klass av växthärledda enzymer, känd som peptidligaser, arbeta för att sammanfoga proteiner. Sådan bindning är en viktig process i utvecklingen av läkemedel, till exempel för att specifikt fästa ett kemoterapiläkemedel till en antikropp som känner igen tumörmarkörer för att rikta cancerceller.

Mer allmänt, peptidligaser är ett användbart verktyg i biotekniska och biomedicinska tillämpningar som proteinmärkning, avbildning och spårning av proteiner i kroppen.

Forskare från NTU Singapore har visat att hemligheten bakom en peptidligas "superlim"-egenskap ligger i två specifika regioner av enzymet som ger det förmågan att fästa sig till andra molekyler, och för att ändra hastigheten med vilken det fungerar.

NTU-teamet ledd av docent Julien Lescar och professor James Tam från NTU School of Biological Sciences använde sin nyvunna kunskap för att utveckla ett nytt labbskapat peptidligas baserat på genetisk information från den kinesiska violen ( Viola yedoensis ), en medicinalväxt med antibiotiska och antiinflammatoriska egenskaper.

Det artificiellt skapade peptidligaset, även känt som ett rekombinant peptidligas, kan bidra till utvecklingen av läkemedel gjorda av komponenter från levande organismer, eftersom det övervinner begränsningarna med nuvarande metoder, såsom biprodukter eller giftiga molekyler som kan förändra ett läkemedels funktion och effekt.

Resultaten publicerades i april i Proceedings of the National Academy of Sciences ( PNAS ).

Docent Julien Lescar, som också är baserad på NTU Institute of Structural Biology (NISB), sa, "Vi har använt det vi har lärt oss i naturen för att konstruera ett rekombinant enzym i labbet. Det fäster sig till ett specifikt protein, som sedan förenas med ett annat specifikt protein eller molekyl. Det här nya sättet att göra saker kan underbygga bättre diagnostiska tester eller läkemedel mot cancer."

För närvarande, under läkemedelsutveckling, proteinmolekyler sys ihop kemiskt. Även om detta är effektivt, processen lämnar biprodukter som kan förändra slutproduktens funktion.

Växthärledda peptidligaser har visat sig vara ett mer tillförlitligt protein "superlim" än ligaser härrörande från bakterier, eller användningen av kemikalier för att binda samman proteiner. Assoc Prof Lescar noterade att växtextraherade enzymer kan bära spår av föroreningar som i sin tur kan utlösa allergier, och tillgängligheten av enzymet är beroende av framgångsrik odling och skörd. I kontrast, det nya NTU-utvecklade rekombinanta enzymet kan produceras i laboratorier i stora mängder utan några biprodukter.

Professor James Tam, som också är med i NISB, sa, "I mycket enkla ordalag, vårt arbete med att skapa dessa ligaser ger en förbättrad plattform för precisionsbiotillverkning av läkemedel, diagnostik och biomaterial."

Att ta ett blad ur naturens bok

NTU-teamet studerade den genetiska informationen hos enzymer extraherade från den kinesiska violen ( Viola yedoensis ) och Kanadaviolen ( Viola canadensis ). Istället för att testa effektiviteten hos dessa extraherade enzymer, forskarna konstruerade fem rekombinanta enzymprover genom att infoga enzymernas gener i en insektscellkultur. Av de fem proverna, tre är peptidligaser. De andra två är proteaser, som är enzymer som klyver proteinmolekyler till mindre peptidkedjor.

Forskarna fann att ett av de rekombinanta peptidligasproverna, VyPAL2, har exceptionella bindningsegenskaper, och är 3, 000 gånger effektivare än tre andra kända typer av ligaser.

Genom en strukturell analys av VyPAL2, NTU-teamet minskade sedan "kontrollcentren" för dess superlimegenskap till två specifika regioner, som de kallade LAD1 och LAD2. LAD1 påverkar hastigheten av enzymaktivitet, while LAD2 determines whether the enzyme exhibits ligase or protease activity.

Turning proteases into peptide ligases

Another discovery stemming from the knowledge of the peptide ligase's molecular mechanism is a method to convert it from being a cutter (a protease) into a joiner (peptide ligase). This can be done by introducing mutations into the LAD1 and LAD2 regions of a protease.

Knowing this conversion process opens up possibilities for identifying novel interesting peptide ligases by simply trawling through protein sequence databases, said Assoc Prof Lescar.

"When you have tens of thousands of proteases, and only a few known peptide ligases, trawling through the sequence databases with the LAD1 and LAD2 regions as the search criteria could lead to the discovery of more proteases that can be converted into peptide ligases. It's like a fishing expedition, but at least now we know where to fish."

Future applications

The team recently received funding from NTUitive, NTU's innovation and enterprise company, and is now working to develop the recombinant enzyme into a product. The product will be eventually sold at Epitoire, a start-up founded by Assoc Prof Lescar. The start-up sells DNA, RNA and protein reagents for academics and researchers who wish to do protein modification.

The team is also partnering both local and overseas medical schools and health institutions to use this recombinant enzyme in diagnostic imaging, such as brain tumor imaging during a surgery.

A patent has been filed for the creation of the recombinant enzyme, as well as the mechanism that converts a protease into a ligase.