Forskare vid Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley Lab) och University of California, Berkeley har kombinerat banbrytande kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) med beräkningsmolekylär modellering för att producera en nära atomär upplösningsmodell av interaktionen mellan mikrotubuli - avgörande komponenter i eukaryota cellultrastruktur - och mikrotubuli-associerade proteiner som kallas tau.

Modellen ger insikt i hur tau stabiliserar mikrotubuli, och vad gör att det dissocierar för att bilda tau-aggregat, eller "trassel, "i vissa neurologiska sjukdomar - inklusive Alzheimers sjukdom - vanligtvis kallade tauopatier.

Mikrotubuli spelar en viktig roll för att upprätthålla cellform, möjliggör vissa former av förflyttning, underlättar intracellulär transport, och segregerande kromosomer under mitos. Varje mikrotubuli är en ihålig cylinder som består av tretton parallella protofilament av tubulinprotein.

Tau hjälper till att hålla mikrotubuli stabila och organiserar dem i buntar. Mutationer eller post-translationella modifieringar, såsom hyperfosforylering, som minskar taus affinitet för mikrotubuli tros bidra till bildandet av tau-trassel.

Laget, ledd av Eva Nogales, en senior fakultetsforskare vid avdelningen Molecular Biophysics and Integrated Bioimaging (MBIB) vid Berkeley Lab och en utredare och professor vid Howard Hughes Medical Institute vid UC Berkeley, använde cryo-EM för att avbilda naturlig fullängds vuxen tau bunden till mikrotubuli med en total upplösning på 4,1 A?. De visade att tau fäster longitudinellt längs toppen av tubulinfilamenten, ett fynd som överensstämmer med en tidigare lågupplöst cryo-EM-studie.

Tau är ett i sig stört protein som inkluderar en projektionsdomän, en mikrotubulibindande region med fyra imperfekta sekvensupprepningar, och en C-terminal domän. Tubulin är en dimer, vilket betyder ett sammanfogat par av närbesläktade polypeptider, i detta fall α-tubulin och β-tubulin. Tubulindimererna träs ihop (eller polymeriserar) från huvud till svans för att bilda protofilamenten som utgör mikrotubuli.

"Med tanke på omfattande litteratur om dess brist på regelbunden struktur, vi var inte säkra på att tau faktiskt skulle bilda ordnade interaktioner med tubulin, " sa Elizabeth Kellogg, en postdoktor i Nogales labb och medförfattare på uppsatsen som presenterar arbetet, publicerad 10 maj i tidskriften Vetenskap .

För att testa hypoteser om vilka tau-rester som är involverade i bindningen till tubulin, de skapade sedan syntetiska tau-konstruktioner med mikrotubulibindande regioner bestående av fyra identiska upprepningar och avbildade även de som var fästa vid mikrotubuli (övergripande upplösning 3,2-3,9 Å). Simon Poepsel, en postdoktor i Nogales labb, hade arbetat med amyloidformen av tau som doktorand och var avgörande för att rena och förbereda proverna för cryo-EM.

"När vi äntligen kunde se längden på en tau-upprepning och se att den hade en definierad struktur och bindningsställe, vi insåg att tau faktiskt bildade specifika interaktioner med tubulinytan, " sa Kellogg. "När vi kunde förena det med längden på en upprepning och sekvensinformationen vi hade, det var nyckeln vi behövde för att ta reda på hur vi skulle förbättra rekonstruktionerna tillräckligt för att möjliggöra atommodellering."

Teamet vände sig sedan till Rosetta, en omfattande svit av beräkningsmodelleringsverktyg för att förutsäga de tredimensionella atomstrukturerna hos makromolekyler från aminosyrasekvensinformation, baserat på konformationen med det lägsta energitillståndet. De högupplösta cryo-EM-kartorna gjorde det möjligt för teamet att sätta begränsningar på den övergripande formen av det molekylära komplexet, öka modellens trohet, Nogales förklarade.

Frank DiMaio, en docent vid institutionen för biokemi och Institute for Protein Design vid University of Washington, bidrog med sin expertis från att arbeta med Rosetta-plattformen, speciellt funktionen "passa till densitet" med användning av kryo-EM-data.

Rosetta structure predictions for two different synthetic tau constructs converged on the same solution:a backbone stretch of 27 residues spanning three tubulin monomers. "The identical sequence register and atomic details from two independent maps underscores the robustness of our solution and provides high confidence in the accuracy of our atomic models, " Nogales said.

"Our structure shows how tau's main contact with the microtubule surface is at the interface between tubulin subunits, serving as a 'stapler' to promote the association between tubulin subunits and explaining how tau promotes microtubule stability, " said Kellogg. "The structure also explains how tau phosphorylation leads to its dissociation from microtubules."

Phosphorylation of the serine at position 262 (universally conserved among tau repeats) has been observed to attenuate microtubule binding and is a marker of Alzheimer's disease. The model shows that phosphorylation at this crucial anchor point would disrupt interaction between tau and the microtubule and thus cause the "staples to fall off". Additional residues that are critical for tau-microtubule binding were identified as well.