En av de största utmaningarna med andra generationens biobränsleproduktion är att identifiera enzymer som produceras av mikroorganismer för användning i en cocktail av enzymer för att katalysera biomassahydrolys där enzymerna samverkar för att bryta ner kolhydraterna i sockerrörsavfall och bagass, till exempel, och omvandla dem till enkla sockerarter för jäsning.

En grupp forskare vid University of Campinas (UNICAMP), arbetar i partnerskap med kollegor vid Brazilian Biorenewables National Laboratory (LNBR) i Campinas, delstaten São Paulo, Brasilien, har upptäckt det Trichoderma harzianum , en svamp som finns i Amazonas, producerar ett enzym med potential att spela en nyckelroll i enzymcocktails.

Enzymet, som kallas β-glukosidas och tillhör glykosidhydrolasfamiljen 1 (GH1), agerar i det sista steget av biomassanedbrytning för att producera fri glukos för jäsning och omvandling till etanol. I laboratoriet, dock, forskarna observerade att höga nivåer av glukos hämmade aktiviteten av β-glukosidas.

"Vi fann också att enzymets optimala katalytiska aktivitet inträffade vid 40 °C. Detta representerade ytterligare ett hinder för användningen av enzymet eftersom det i en industriell miljö, den enzymatiska hydrolysen av biomassa utförs vid högre temperaturer, vanligtvis runt 50 °C, " sa Clelton Aparecido dos Santos, en postdoktor vid UNICAMPs Center for Molecular Biology and Genetic Engineering (CBMEG) med ett stipendium från FAPESP.

Baserat på en analys av enzymets struktur kombinerat med genomik och molekylärbiologiska tekniker, forskarna kunde modifiera strukturen för att lösa dessa problem och avsevärt förbättra dess biomassanedbrytningseffektivitet.

Studien är resultatet av ett projekt med ett vanligt forskningsanslag från FAPESP och ett tematiskt projekt som också stöds av FAPESP. Resultaten publiceras i tidskriften Vetenskapliga rapporter .

"Det modifierade proteinet vi utvecklade visade sig vara mycket mer effektivt än det omodifierade enzymet och kan användas för att komplettera de enzymcocktails som säljs idag för att bryta ner biomassa och producera andra generationens biobränslen, " berättade Santos.

För att komma fram till det modifierade proteinet, forskarna jämförde initialt kristallstrukturen hos den ursprungliga molekylen med strukturer av andra vildtyps-β-glukosidaser i GH1- och GH3-glykosidhydrolasfamiljerna. Resultaten av analysen visade att glukostoleranta GH1-glukosidaser hade en djupare och smalare substratkanal än andra β-glukosidaser och att denna kanal begränsade glukostillgången till enzymets aktiva plats.

Mindre glukostoleranta β-glukosidaser hade en grundare men bredare ingångskanal för den aktiva platsen, tillåta mer av glukosen som produceras av dessa enzymer att komma in i det sista stadiet av biomassanedbrytning. Bibehållen glukos blockerar proteinets kanal och minskar dess katalytiska aktivitet.

Baserat på denna observation, forskarna använde en molekylärbiologisk teknik som kallas platsstyrd mutagenes för att ersätta två aminosyror som kan fungera som "portvakter" vid ingången till enzymets aktiva plats, släppa in glukos eller blockera det. Analys av deras experiment visade att modifieringen minskade kanalen till den aktiva platsen.

"Det mutanta enzymets aktiva ställe krympte till samma storlek som de glukostoleranta GH1 β-glukosidaserna, sa Santos.

Förbättrad effektivitet

Forskarna genomförde ett antal experiment för att mäta det förbättrade proteinets prestanda när det gäller att bryta ner biomassa, speciellt sockerrörsbagasse, ett agroindustriellt avfall med stor potential för lönsam användning i Brasilien. Under en forskarpraktik utomlands med ett stipendium från São Paulo Research Foundation—FAPESP, Santos arbetade med en forskargrupp ledd av Paul Dupree, professor vid University of Cambridge i Storbritannien, på en analys av det skräddarsydda enzymets glukosfrisättningseffektivitet när olika källor till växtbiomassa omvandlades.

Analysen visade att den katalytiska effektiviteten för det modifierade enzymet var 300 % högre än den för vildtypsenzymet vad gäller frisättning av glukos. Dessutom, det var mer glukostolerant, så mer glukos frigjordes från alla testade växtbiomassaråvaror. Mutationen förstärkte också enzymets termiska stabilitet under fermentering.

"Mutation av de två aminosyrorna på den aktiva platsen gjorde enzymet supereffektivt. Det är redo för industriell användning, sa Anete Pereira de Souza, en professor vid UNICAMP och huvudutredare för projektet. "En av enzymets fördelar är att det produceras in vitro och inte från en modifierad svamp eller annan organism, så det kan masstillverkas till relativt låg kostnad."