En enda molekyl avbildningsteknik, kallas proteininducerad fluorescensförstärkning (PIFE), har fått draghjälp de senaste åren som ett populärt verktyg för att observera DNA–proteininteraktioner med nanometerprecision. Än, enligt en ny KAUST -studie, forskningslaboratorier har inte använt tekniken till sin fulla potential.

PIFE-analysen bygger på idén att DNA märkt med ett fluorescerande färgämne kommer att lysa starkare när proteiner binds i närheten. I många fall, detta är sant – vilket har fått många forskare att använda PIFE framför andra mer arbetsintensiva tekniker som bygger på dubbel märkning av proteiner och DNA.

Men Samir Hamdans doktorander Fahad Rashid, Manal Zaher och Vlad-Stefan Raducanu insåg att proteinbindning till DNA-färgkomplex kan ibland också ha motsatt effekt. Istället för att förstärka den fluorescerande signalen, proteininteraktioner kan ibland dämpa glöden, beroende på vissa egenskaper hos systemet.

Hamdan berömmer sina elevers nyfikenhet för att ha gjort denna observation och detaljerat hur det fungerar. Inspiration från Rashids tidigare arbete ledde laget till fenomenet de kallar proteininducerad fluorescenssläckning (PIFQ). Och som Rashid förklarar, "Vi bestämde oss för att bättre definiera de förhållanden som leder till lysrör eller byster."

Genom en kombination av experimentella och beräkningsanalyser, KAUST-teamet visade att det initiala fluorescenstillståndet för DNA-färgämneskomplexet avgör om PIFE eller PIFQ kommer att resultera efter proteinbindning. Utan denna kunskap, sannolikheten för endera händelsen blir ekvivalent med ett myntkast, vilket kan äventyra den mekanistiska tolkningen av laboratorieresultat.

"När insikt i detta initiala tillstånd erhålls från fluorescens och strukturarbete, att förutse endera effekten blir experimentellt genomförbar, "Förklarar Raducanu.

Faktorer som DNA-sekvens och färgämnesposition kan tippa balansen mot PIFE eller PIFQ; KAUST-teamet blev så bra på att tolka molekylkoden att de exakt kunde förutsäga vad som skulle hända helt enkelt genom att mäta hur dessa parametrar påverkar det ursprungliga fluorescensläget för DNA-färgämnesystemet.

"Vi förvandlade varje mätning till ett spel, " säger Zaher, "och vi är glada att kunna säga att vår hypotes förutspådde resultatet mer än 90 procent av gångerna!"

Dessa nya insikter borde dramatiskt utöka räckvidden och experimentella löftet för detta kraftfulla enmolekylära bildverktyg, förutspår Raducanu. "Genom att introducera PIFQ, Vi erbjuder forskare inom området möjlighet att ta upp flera biologiska frågor där PIFE kanske inte har bevittnat, " han säger.

Forskare kan också välja att kombinera PIFE och PIFQ för att dechiffrera flerstegs- och multiproteinprocesser med bara en enda DNA-färgämneskonstruktion.

"Om man tar hänsyn till den kontextberoende karaktären av fluorescensmodulering i DNA-färgämnessystemet öppnar dörren till många möjligheter inom experimentell design som skulle kunna skräddarsys efter forskarnas behov, " säger Zaher.

"Vi räknar nu med att tolkning av data och tillskrivning av molekylära händelser från enmolekylära data blir lättare och mer exakt, "Tillägger Rashid.