Zoë Fisher och Katarina Koruza från ESS Deuteration and Macromolecular Crystallization (DEMAX) Support lab och Lunds universitet har använt ångdiffusionsmetoder för att odla stora proteinkristaller för neutrontekniker som en del av SINE2020:s Crystal Growth -arbetspaket. Dock, förutom att kunna odla kristaller som är tillräckligt stora för dessa tekniker, de vill också göra dem deutererade. Deutererade versioner möjliggör förbättrat signal-brusförhållande, minskad osammanhängande bakgrund och användning av kontrastvariationer.

Teamet har försökt att göra stora kristaller av olika proteiner inklusive membranproteinet Tomato -tymidinkinas (TOTK1) och Superoxiddismutas (bSOD) som finns i alla organismer och är involverat i åldringsprocessen. Dock, även om de lyckades växa fina kristaller var de bara inte tillräckligt stora - mindre än 0,1 mm3.

Men Zoë och Katarina har haft mycket större framgång med humana kolsyraanhydras (HCA) proteiner. Särskilt HCA IX -proteinet är inblandat i metastaser i cancer och har framträtt som ett möjligt mål för cancerdetektering, bildbehandling, och behandling. Neutrontekniker kan ge detaljer om den aktiva platsen - vätebindning, vattenorganisation, ligandbindande-det skulle hjälpa till med utformningen av förbättrade cancerläkemedel.

Vild typ HCA II, HCA IX Mimic (där en del av HCA II -molekylen har anpassats för att efterlikna det aktiva stället för HCA IX -proteinet) och en HCA IX -ytvariant (SV), som har 6 ytmutationer för att göra den mer löslig och stabil, var de proteiner som valdes för projektet. När det inte är effektivt att göra deutererade proteiner genom att göra dem från grunden eller köpa dem kommersiellt, de deutereras via HD-växel där det "blötläggs" i en deutererad lösning (buffert). För detta arbete uttrycktes de alla i E. coli under vätehaltiga och deutererade förhållanden för att göra H- och D -versioner.

De bestämde sig sedan för att kristallisera proteinerna med hjälp av ångdiffusionsmetoder så att kristallerna kunde studeras med både röntgen- och neutronkristallografi.

Detta var ingen lätt uppgift. Proteiner är mycket känsliga. Det var nödvändigt att använda uppställningar som är stabila under långa inkubations- och jämviktstider. Temperaturen, avdunstningshastigheter, pH och protein- och utfällningskoncentrationer måste alla kontrolleras noggrant med hjälp av kristallisationsbrunnar och automatisk kontroll, till exempel att variera temperaturen upp och ner efter behov.

Dessutom, för att göra kristaller tillräckligt stora för neutronkristallografi, du måste använda en stor mängd utgångsmaterial, vanligtvis 100-500 mikroliter eller 100s mg. Dessa stora volymer innebär att kristalltillväxten är långsam - så förhållandena måste kontrolleras i många månader i taget.

Tyvärr, kristallutbytet som erhållits för deutererade versionerna var inte lika bra som för de vätehaltiga versionerna, producerar regelbundet färre och mindre kristaller. Det upptäcktes att du för vissa deutererade proteiner inte alls kunde använda de förhållanden som fungerade för de vätehaltiga versionerna och att förhållandena behövde optimeras ytterligare för att odla deutererade kristaller.

Men med uthållighet, Zoë och Katarina har framgångsrikt lyckats odla en HCA (IX) SV -kristall över 1 mm3 och en 1,8 mm3 kristall av HCA (IX) efterlikna. De har nu kunnat få röntgenresultat och även neutronresultat från LADI vid ILL och iBIX i Japan.