Typiska vägar för att göra per-deutererade molekyler för neutronspridning använder kemiska metoder som är olämpliga för molekyler med känsliga funktionella grupper, till exempel användningen av metallkatalysatorer, hög temperatur och högt tryck. Därför, Uppgift 5.3 i SINE2020:s Chemical Deuteration-arbetspaket undersökte användningen av enzymkatalysatorer som är effektiva, mycket molekylspecifika och genererar få eller inga biprodukter under deuterationsprocessen.

SINE2020-kollegor vid ESS i Sverige och FZJ i Tyskland har tittat på polymeren polymjölksyra. Neutronspridning är en idealisk metod för att studera strukturen och egenskaperna hos polymjölksyra, men för att göra analysen enklare och mer användbar, deutererade former av polymeren krävs.

Polymjölksyra är gjord av byggstenar (eller monomerer) av mjölksyra sammanfogade och de finns i två former som är spegelbilder (eller enantiomerer) av varandra. Polymerens biologiska nedbrytbarhet kan anpassas genom att sammanfoga en blandning av dessa enantiomerer, vilket gör det viktigt att deutererade versioner av båda mjölksyraenantiomererna finns tillgängliga.

Anna Leung och Hanna Wacklin-Knecht från ESS har gjort deutererade mjölksyramonomerer med hjälp av enzymer. Dessa har sedan använts av Andreas Raba och Jürgen Allgaier vid FZJ och Klaus Beckerle vid RWTH Aachen University för att göra deutererad polymjölksyra.

Att göra mjölksyra

Först, en deutererad version av prekursorn natriumpyruvat gjordes, vilket tar ca 3 dagar. Detta omvandlas till laktat i en enzymreaktion under cirka 10 dagar, med hjälp av enzymet Laktatdehydrogenas. Det är då lätt att byta laktatet till mjölksyra. De olika L- och D-enantiomererna gjordes med användning av en specifik version av Laktatdehydrogenasenzymet i varje fall.

Deuteration av lipider

Syntesen av mjölksyra var inte det enda laget ville utforska med enzymer. En annan intressant molekylgrupp att deuterera för neutronteknik är lipider, som ILL producerar biologiskt.

För att bygga en deutererad lipid gör du huvudgruppen och "benen" på molekylen separat och förenar dem sedan. Detta görs ofta kemiskt, men kanske enzymer kan vara användbara för denna process. Enzymer kunde ta bort "benen" ett i taget och återfästa deutererade versioner redo för neutronexperiment.

Anna började utforska fosfolipasenzymer för denna uppgift. Dock, det var inte lätt. Oliver Bogojevic gick med i projektet 2018, tillföra kunskap om enzymstruktur och funktion samt erfarenhet av att arbeta med enzymmanipulation. Fortfarande, enzymer är utmanande saker att arbeta med och Anna och Oliver lärde sig hela tiden saker genom att trial and error. Enzymer denaturerades lätt av höga temperaturer eller förändringar i pH och de fann att vissa enzymer har mycket snäv substratspecificitet medan andra accepterar ett brett spektrum av substrat. Reaktionerna behövde ständig övervakning och det var svårt att veta hur man skulle analysera produkterna vad gäller renhet.

Det var också komplicerat att öka produktionens skala för att göra större mängder, t.ex. upp till 100 mg perdeutererad förening. Detta beror på att om du har mer utgångsmaterial, de gränsytor där de viktiga växelverkan sker skalas inte på samma sätt, dvs en fördubbling av utgångsmaterialet fördubblar inte automatiskt den tillgängliga ytarean. Teamet var tvungen att undersöka metoder för att blanda reaktanterna för att öka gränsytan på lämpligt sätt. Arbetet med detta projekt fortsätter; ESS DEMAX-teamet erbjöd deutererade fosfolipider i sin första ansökningsomgång, utgiven tidigare i år.

Trots utmaningarna, dock, det finns några stora fördelar med att använda enzymer. De är väldigt selektiva, inte kemiskt giftig, återanvändbar och antalet steg som krävs i en syntesprocess reduceras.

Arbetet som utförts för SINE2020 har etablerat en enzymkatalysmetod, inte bara för dessa molekyler, men en som borde vara kompatibel med ett stort antal andra substrat och enzymreaktioner. Detta kommer att hjälpa till att utöka användarnas tillgång till ett stort utbud av högvärdiga deutererade små molekyler med neutronspridningsapplikationer.