Det skulle vara omöjligt att förstå livet utan att ha ett fast grepp om de mikroskopiska interaktionerna mellan molekyler som förekommer i och runt celler. Mikroskop är och har varit ett ovärderligt verktyg för forskare i detta avseende, och många olika typer av mikroskop och mikroskopitekniker finns. Följaktligen, dessa olika tekniker tjänar olika syften och har fördelar och nackdelar.

I synnerhet inom biologi och medicin, forskare söker mikroskopitekniker för att få tredimensionell information om arrangemang och orientering av enskilda molekyler i celler i nanometerskala. Ett troligt tillvägagångssätt för att uppnå detta är kryogen (det vill säga vid extremt låga temperaturer) elektrontomografi. Dock, denna teknik kan inte användas för att observera cellens inre och är begränsad till tunna skivor extraherade från provcellen, vilket inte är lika användbart som att direkt kunna lokalisera molekyler i intakta celler.

För att få mer användbara mätningar, synligt ljus kan användas för att belysa speciella prover i det som kallas fluorescensmikroskopi. När du använder denna metod, målmolekylerna är märkta med "fluoroforer, "som är små molekyler som absorberar energi från ljus av en specifik färg (frekvens) och sedan avger det igen genom att lysa. Även om detta tillvägagångssätt har rapporterats vara användbart för att lokalisera enskilda fluoroforer i XY-planet (en plan yta), meningsfull 3D-lokalisering av biomolekyler kräver mer precision i Z-riktningen, eller djup, än vad som är möjligt för närvarande.

Det är därför ett team av forskare från Tokyo Tech inklusive Dr Satoru Fujiyoshi, Nagoya-universitetet och Kyoto-universitetet fördjupade sig djupt i kryofluorescensmikroskopi för att få insikt i felkällorna i sådana mätningar och sätt att korrigera dem. Proverna de använde var DNA -molekyler med känd längd (10 nanometer) med olika fluoroforer i varje ände.

Initialt, efter att ha tagit bilder av båda fluoroforerna och bestämt avståndet mellan dem för att se om det motsvarade DNA -molekylernas längd, det var betydande fel i deras mätningar. Detta orsakades av orienteringen av fluoroforen i 3D-utrymme, som inte alltid var helt i linje med observationsplanet och istället lutade eller lutade. Detta är känt som "dipolorienteringseffekten" och är en allvarlig begränsande faktor vid fluorescensmikroskopi. Effekten är kopplad till den dåliga mätprecisionen i Z-riktningen och, som forskarna visat, kan korrigeras.

Det är här mätning vid kryogena förhållanden spelar in. Molekylerna fryses omedelbart på plats, möjliggör 3D-mätningar med hög precision som motverkar dipolorienteringseffekten. Precisionen (reproducerbarheten) med vilken fluoroforerna befann sig var ± 1 nanometer på observationsplanet och ± 11 nanometer i Z-riktningen, eller djup, vilket är utan motstycke för denna typ av mikroskopi. Genom dessa korrigeringar, forskarna lyckades lokalisera fluoroforerna på DNA -molekylerna med nanometernoggrannhet (överensstämmelse med verkligt värde). "Genom att korrigera dipolorienteringseffekten, vi lyckades förbättra lokaliseringsnoggrannheten för dessa fluoroforer ner till nanometernivå, "säger Dr. Fujiyoshi.

Forskargruppen kommer att fortsätta sitt arbete med detta tillvägagångssätt med hjälp av ett par fluoroforer speciellt utformade för kryogena förhållanden, som de förväntar sig att få ännu bättre resultat. "Denna typ av kryofluorescensmikroskopi kommer att bidra till att avslöja mekanismerna och processerna inuti cellerna på en molekylär nivå, "säger Dr Fujiyoshi.